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四川兵工学报 2015年第6期36卷 153-156,160页

作者：肖美芳王昌富周义正邱晓燕华中科技大学附属荆州医院湖北荆州434020

目的本研究旨在构建β-内酰胺酶E166C突变体并于大肠杆菌中原核表达,纯化及鉴定该蛋白。方法利用体外PCR扩增获得β-内酰胺酶pen P突变质粒并通过DNA测序鉴定,将重组质粒转化至BL21(DE3)中,以IPTG诱导蛋白表达。菌液超声裂解后首先以镍... 详细信息

目的本研究旨在构建β-内酰胺酶E166C突变体并于大肠杆菌中原核表达,纯化及鉴定该蛋白。方法利用体外PCR扩增获得β-内酰胺酶pen P突变质粒并通过DNA测序鉴定,将重组质粒转化至BL21(DE3)中,以IPTG诱导蛋白表达。菌液超声裂解后首先以镍柱纯化融合蛋白,蛋白水解酶HRV3C除去融合标签,然后用凝胶过滤层析色谱进一步纯化得到目标蛋白,最后应用SDS-PAGE和电喷雾质谱法鉴定纯化的目标蛋白。结果成功构建了β-内酰胺酶pen P-E166C突变质粒,并且先后通过亲和镍柱和凝胶过滤层析柱纯化获得了纯度非常高的单一蛋白,SDSPAGE和电喷雾质谱法确定蛋白的分子量与理论值一致。结论本课题获得的pen P的活性位点突变体E166C蛋白将用于以后进一步的研究,可以有助于我们从分子水平上去研究抗生素和β-内酰胺酶的相互作用。

关键词： β-内酰胺酶E166C突变体 PCR-介导的定点突变蛋白纯化及鉴定

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