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华中五味子酮对阿尔茨海默病样大鼠脑组织蛋白热稳定性的影响

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实用老年医学 2010年第3期24卷 203-205,212页

作者：胡毓洪拓西平陈海生杨贤兵于方吕建勇第二军医大学附属长海医院老年病科上海市200433 第二军医大学药学院天然药物化学教研室上海市200438

目的观察华中五味子酮对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(AD)模型鼠脑组织蛋白稳定性的影响。方法 36只SD大鼠随机分为3组:空白对照组、AD模型组和华中五味子酮干预组,每组12只。采用侧脑室内注射Aβ溶液的方法建立AD大鼠模型,予... 详细信息

目的观察华中五味子酮对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(AD)模型鼠脑组织蛋白稳定性的影响。方法 36只SD大鼠随机分为3组:空白对照组、AD模型组和华中五味子酮干预组,每组12只。采用侧脑室内注射Aβ溶液的方法建立AD大鼠模型,予五味子酮油灌胃干预。Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力;提取大鼠脑组织蛋白,检测各组蛋白在固定温度下,随时间改变的340nm处的吸光度(OD)值。结果五味子酮干预组与AD模型组比较,从第2天开始其逃避潜伏期缩短(P蛋白热稳定性具有保护作用。

关键词：阿尔茨海默病蛋白热稳定性华中五味子酮

融合超嗜热菌Pyrococcus furiosus红素氧还蛋白可提高靶蛋白的热稳定性

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生物技术通报 2021年第10期37卷 110-119页

作者：吴娇余桂珍袁航刘娴高艳秀龚明邹竹荣云南师范大学生命科学学院云南省生物质能源和环境生物技术重点实验室教育部生物质能源持续发展和应用工程研究中心昆明650500

热稳定性是功能蛋白(特别是酶蛋白)储存和使用的重要限制因子。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件而无法被采用;另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提... 详细信息

热稳定性是功能蛋白(特别是酶蛋白)储存和使用的重要限制因子。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件而无法被采用;另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提高其热稳定性,进而提升其功效和扩大其应用范围,具有重要的现实意义。选取3种典型的热稳定性差、易聚集但具有重要功能的酶蛋白(小桐子抗坏血酸过氧化物酶1即JcAPX1、大肠杆菌高丝氨酸-O-转琥珀酰酶即EcMetA、假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶即PsPtxD)作为靶蛋白,鉴定出超嗜热菌Pyrococcus furiosus的小分子红素氧还蛋白(rubredoxin)能够作为热稳定融合标签,提高大肠杆菌重组表达靶蛋白的可溶性、热稳定性及其活性的耐热能力,为通过融合表达策略提高目标蛋白的热稳定性并强化其应用提供了一个新的技术选择。

关键词：蛋白热稳定性融合标签超嗜热菌 Pyrococcus furiosus 红素氧还蛋白

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三七蛋白提取及热稳定性研究

食品工业 2017年第8期38卷 165-168页

作者：李晓梅睢博文赵雨赵大庆长春中医药大学长春130117

研究三七蛋白的提取工艺和热稳定性。采用单因素考察和L9(33)正交试验法,利用Bradford法测定三七提取液中总蛋白含量,以总蛋白含量为指标进行考察,优选提取工艺方案;采用SDS-PAGE凝胶电泳法,探究不同加热温度和加热时间对蛋白稳定性的... 详细信息

研究三七蛋白的提取工艺和热稳定性。采用单因素考察和L9(33)正交试验法,利用Bradford法测定三七提取液中总蛋白含量,以总蛋白含量为指标进行考察,优选提取工艺方案;采用SDS-PAGE凝胶电泳法,探究不同加热温度和加热时间对蛋白稳定性的影响。结果表明,缓冲溶液的pH对三七蛋白提取率有显著影响。确定最佳提取工艺为:用1.5倍药材量的pH 9的缓冲溶液在4℃条件下浸提2次,每次24 h;三七蛋白热稳定性试验结果表明,蛋白稳定性随着加热温度的升高而发生变化,各种蛋白亚基的热敏感性各不相同;在70℃时,三七蛋白亚基的含量基本不随加热时间改变。优化得到的数据合理,重复性良好,可为三七蛋白的提取工艺及蛋白热稳定性研究提供试验依据。

关键词：三七蛋白提取工艺蛋白热稳定性 SDS-PAGE凝胶电泳

新型高甜度及强热稳定性甜味蛋白monellin突变体的分子构建

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新型高甜度及强热稳定性甜味蛋白monellin突变体的分子构建

作者：蔡成固齐鲁工业大学

学位级别：硕士

甜味蛋白monellin是一种高甜度,低热量的甜味物质,由于本身不含糖分,未来有望成为糖尿病和龋齿病患者的甜味替代品。但是由于其生产成本高、热稳定性低等原因限制了其大规模工业化生产的进程。本研究针对如何提高甜味蛋白monellin甜度... 详细信息

甜味蛋白monellin是一种高甜度,低热量的甜味物质,由于本身不含糖分,未来有望成为糖尿病和龋齿病患者的甜味替代品。但是由于其生产成本高、热稳定性低等原因限制了其大规模工业化生产的进程。本研究针对如何提高甜味蛋白monellin甜度及热稳定性进行了研究。将前期工作中构建成功的pET15b-MNEI重组质粒导入到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-R-IL中进行蛋白表达,经过镍离子柱亲和层析纯化和分子筛层析纯化后获得了纯度较高的目的蛋白。随后,采用人工品尝双盲评审法测定野生型monellin蛋白的甜味阈值为1.1μg/ml;熔点温度确定采用圆二色谱仪测定蛋白在升温过程中的圆二色光谱变化,经过分析计算得到野生型monellin蛋白的熔点温度(T)值为74.2℃。为了提高monellin蛋白的甜度和热稳定性,我们分析了单链monellin蛋白的三维结构,从影响甜度和稳定性的因素出发,通过改变蛋白表面电荷、蛋白内部疏水性作用、范德华力等分子间作用力对monellin蛋白设计了一系列突变位点。通过对突变体蛋白理化性质测定得到了E2N、E23A、Y65R三个优良突变体蛋白,同时发现了六个双突变可以导致monellin蛋白集聚,丧失活性。为了得到性质更加优良的突变体蛋白,我们将E2N、E23A、Y65R三个突变体蛋白排列组合后,最终得到了一个甜度和热稳定性均明显提高的双突变蛋白E2N/E23A,该突变体蛋白的甜味阈值降至0.38μg/ml,熔点温度提升至84.9℃。通过对突变体蛋白分析,我们发现甜味蛋白质内部带电荷氨基酸的离子化状态是影响其热稳定性的关键因素,而蛋白质表面带电荷氨基酸对其甜味具有重要影响。本研究通过定点突变方法提高了monellin蛋白的甜度和热稳定性,得到的突变体蛋白E2N/E23A有望应用于monellin蛋白的大规模工业化生产。此外,发现了蛋白内部一些维持结构骨架的重要氨基酸位点,为此后研究该蛋白的稳定性与集聚性质奠定了基础。

关键词：甜味蛋白monellin 基因定点突变甜味阈值蛋白热稳定性圆二色光谱

蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能

同方学位论文库评论

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昆虫学报 2012年第8期55卷 903-910页

作者：王欢李凯方琦叶恭银上海农林职业技术学院上海201699 浙江大学昆虫科学研究所杭州310058 东华大学生物科学与技术研究所上海201620

作为分子伴侣,热激蛋白可起修复变性蛋白与阻止其他蛋白质聚集的作用。为进一步理解蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum热激蛋白家族的分子伴侣功能,本研究对来自该寄生蜂的热激蛋白Pphsp90,Pphsp70,Pphsc70,Pphsp60,Pphsp40和Pphsp20的基因... 详细信息

作为分子伴侣,热激蛋白可起修复变性蛋白与阻止其他蛋白质聚集的作用。为进一步理解蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum热激蛋白家族的分子伴侣功能,本研究对来自该寄生蜂的热激蛋白Pphsp90,Pphsp70,Pphsc70,Pphsp60,Pphsp40和Pphsp20的基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中进行了过表达。结果表明:除Pphsp40外,其余5个基因均得到高效表达,且表达的重组热激蛋白在高温下(80℃)具可溶性与热稳定性。其中,Pphsp20与Pphsp90在大肠杆菌中的表达显著提高了高温下(50℃,1h)细胞的存活率。离体活性实验证实,利用纯化的融合蛋白Pphsp20可减少高温下荧光素酶的聚集现象。据此认为,Pphsp20与Pphsp90均具有大肠杆菌细胞的热保护功能,但Pphsp20可以单独发挥作用,而Pphsp90可能需其他因子协同作用才有保护活性。

关键词：蝶蛹金小蜂热激蛋白基因表达蛋白热稳定性蛋白纯化

甜味蛋白monellin分子的理性设计及改造

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甜味蛋白monellin分子的理性设计及改造

作者：刘秋蕾齐鲁工业大学

学位级别：硕士

甜味蛋白monellin(莫内林)由于自身具有高甜味(约为蔗糖的3000倍)和低卡路里的特点,因此在食品应用方面有较强的潜在价值。但是天然状态下甜味蛋白monellin的耐热稳定性及耐酸碱稳定性较弱,使得monellin在食品应用方面受到了极大的限制... 详细信息

甜味蛋白monellin(莫内林)由于自身具有高甜味(约为蔗糖的3000倍)和低卡路里的特点,因此在食品应用方面有较强的潜在价值。但是天然状态下甜味蛋白monellin的耐热稳定性及耐酸碱稳定性较弱,使得monellin在食品应用方面受到了极大的限制。本研究中,我们首先根据甜味蛋白monellin的氨基酸序列(GenBank:AFF58925.1),结合细菌密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,构建重组质粒并将其导入到大肠杆菌内进行表达,然后通过镍亲和层析以及分子筛层析分离纯化获得较纯蛋白收集液。纯化后的蛋白液进行透析实验,然后通过相关实验对其甜味阈值及热稳定进行研究。进一步利用凝血酶对表达蛋白进行酶切实验,验证组氨酸标签并不会对甜味蛋白产生影响。我们针对甜味蛋白monellin热稳定性较低这一特性,通过序列和结构分析及基因突变的手段改变蛋白上不同位点的氨基酸,实现蛋白热稳性提高且甜度不会下降的目的。在这些突变中效果最为显著的为突变体E23A和C41A,前者是保持甜味阈值不升高且热稳定性相较于单链甜味蛋白monellin显著提高,可在85°C温度下保持30 min不变性,后者则是热稳定性有较小的提升,且甜味阈值降低,比野生型甜味蛋白monellin甜度还要高。此外,我们还发现能够提高蛋白热稳定性的突变体的氨基酸位点分布于α-螺旋的两端。经过本研究,我们证明可以通过基因突变手段来提高甜味蛋白monellin的稳定性,实现甜味蛋白monellin的工业化生产,为人类提供了一种新型糖类替代品。

关键词：甜味蛋白monellin 甜味阈值蛋白热稳定性定点突变

UNcle高通量蛋白稳定系统分析3种反转录酶

同方学位论文库评论

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分析仪器 2022年第2期 64-72页

作者：武瑶安琳中国科学院微生物研究所北京100101

目的:反转录酶的热稳定性是重要的质控参数,利用UNcle高通量蛋白稳定分析仪多种检测功能对反转录酶热稳定性进行表征。方法:比较qRT-PCR方法及UNcle系统对3种反转录酶的热稳定检测,并利用UNcle荧光光谱分析核苷类反转录酶抑制剂去羟肌... 详细信息

目的:反转录酶的热稳定性是重要的质控参数,利用UNcle高通量蛋白稳定分析仪多种检测功能对反转录酶热稳定性进行表征。方法:比较qRT-PCR方法及UNcle系统对3种反转录酶的热稳定检测,并利用UNcle荧光光谱分析核苷类反转录酶抑制剂去羟肌苷对反转录酶的影响。结果:利用高通量蛋白稳定性分析系统UNcle进行反转录酶熔解温度Tm、聚集起始温度Tagg及蛋白均一度分析。和qRT-PCR检测结果相比,3种反转录酶的热稳定性顺序一致,但各自检测的Tm数值差距较大。比较这两种方法的前处理,UNcle不需要外源添加染料,即没有引入外来变量直接检测,可以更加准确反映反转录酶本身的Tm值。结论:提供了一种新的快速准确表征反转录酶热稳定性的方法,为反转录酶的研发质控提供重要检测依据,并为UNcle在其他蛋白的热稳定分析提供借鉴参考意义。

关键词：反转录酶蛋白热稳定性核苷类逆转录酶抑制剂去羟肌苷

维普期刊数据库博看期刊

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热力学研究辅料与蛋白药物之间的相互作用

中国生化药物杂志 2015年第7期35卷 5-9页

作者：王文娟王炳全韩军聊城大学生物制药研究院药学院山东聊城252059

目的研究不同辅料(氨基酸、糖类、非离子型表面活性剂)对蛋白药物IgG1单抗热稳定性的影响,探讨辅料与蛋白之间的相互作用,判断辅料与蛋白之间是否存在结合作用。方法通过差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)获得蛋... 详细信息

目的研究不同辅料(氨基酸、糖类、非离子型表面活性剂)对蛋白药物IgG1单抗热稳定性的影响,探讨辅料与蛋白之间的相互作用,判断辅料与蛋白之间是否存在结合作用。方法通过差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)获得蛋白的变性温度(Tm)或蛋白某一结构域的变性温度。采用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)测定蛋白与不同辅料之间的相互作用。结果带负电荷的氨基酸可以明显降低IgG1单抗的变性温度(△Tm>9℃),其他辅料作用不明显(△Tm蛋白稳定性的影响不同,在p H=5时带负电荷的氨基酸对IgG1单抗热稳定性的影响大于pH=7时。ITC实验数据显示各种辅料和IgG1单抗的滴定等温线近乎一条直线。结论 IgG1单抗与辅料之间不存在特异性相互作用,带负电荷的氨基酸可以明显降低IgG1单抗的变性温度,应该归功于2者之间的静电相互作用。

关键词：蛋白制剂 IgG1单抗蛋白热稳定性辅料氨基酸相互作用