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合成生物学 2024年第2期5卷 338-352页

作者：叶精勤黄文华潘超朱力王恒樑军事科学院军事医学研究院病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术... 详细信息

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术发展迅速,已被广泛应用于病原细菌多糖结合疫苗的生物合成制备。本文综述了该技术体系中的寡糖转移酶元件、载体蛋白元件、异源多糖抗原合成线路以及工程菌株改造等核心关键模块的最新研究进展。使用生物活体系统,发酵生产多糖结合疫苗,具有产物均一性好、步骤简便、绿色环保等优势,是一种亟待发展的新兴技术,同时也存在一些技术细节需要完善。未来,寡糖转移酶的定向进化、纳米颗粒型蛋白载体的应用、多糖合成基因的组合重排、工程菌株的代谢途径优化,将有望进一步促进多糖结合疫苗的生物合成研究。

关键词：糖合成生物学多糖结合疫苗蛋白多糖偶联技术寡糖转移酶

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两种细菌纳米多糖结合疫苗的制备与评价

两种细菌纳米多糖结合疫苗的制备与评价

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作者：王康丰河北大学

学位级别：硕士

病原细菌感染严重威胁人类健康,而免疫接种是传染病预防最为经济有效的手段。细菌的胞外多糖(主要为CPS和O-PS)是造成细菌侵袭性感染的重要毒力因子,同时也是防控这些细菌感染的疫苗的主要抗原成分。由于这些多糖大多属于胸腺非依赖(T-i... 详细信息

病原细菌感染严重威胁人类健康,而免疫接种是传染病预防最为经济有效的手段。细菌的胞外多糖(主要为CPS和O-PS)是造成细菌侵袭性感染的重要毒力因子,同时也是防控这些细菌感染的疫苗的主要抗原成分。由于这些多糖大多属于胸腺非依赖(T-independent,TI)抗原,不能形成免疫记性B细胞,尤其对2岁以下的婴幼儿、老年人、部分免疫缺陷患者等人群不能提供足够的保护力,因此可采用多糖结合疫苗策略:将具有可变结构和数量的多糖单元与非糖单元(蛋白质或短肽、脂类)通过共价连接形成蛋白质-多糖结合疫苗。非糖单元发挥类似佐剂的作用,激活辅助性T细胞继而促进B细胞成熟分化形成记忆,从而提供长期免疫保护。因此,本研究分别针对革兰氏阳性和阴性细菌制备多糖结合疫苗。目的:分别制备革兰氏阳性细菌肺炎链球菌和革兰氏阴性细菌志贺氏菌多糖结疫苗并探索新的疫苗免疫策略,开发出更加安全、高效的候选多糖结合疫苗品种。方法:选取由本实验室构建的具备高异源糖蛋白表达效率的W3110△waa L△wbb H-L作为表达宿主,通过引入肺炎链球菌K5血清型荚膜多糖表达载体p BAC-CPS,同时分别引入糖基化系统质粒p ET28a-pgl L-CTB和p ET28a-pgl L-CTBTri,在大肠杆菌中利用蛋白多糖偶联技术(Protein glycan coupling technologies,PGCT)直接合成了K5血清型的分别以CTB和CTBTri纳米颗粒(NP)为载体的多糖结合疫苗,并对两种疫苗粒径大小、血清抗体效价、保护率、体外杀菌效率等指标进行评价。利用实验室制备的较为成熟且产量较高的志贺氏菌多糖结合疫苗NP-OPS结合微针制备技术,将其制成微针片剂,通过经皮免疫方式进行动物免疫,并对其免疫效果进行综合评价;同时结合PGCT和O-糖基化系统,制备以Spy Catcher为底物蛋白的志贺氏菌糖蛋白SC-OPS,与Spy Tag-HBC-VLPs在体外进行连接,从而将志贺氏菌多糖展示在其表面,并对制备的纳米多糖结合疫苗进行粒径大小的检测和免疫效果评价。结果:利用肺炎链球菌血清型K5荚膜多糖表达载体,在大肠杆菌中首次利用糖基转移酶Pgl L直接合成K5血清型的以CTB和NP为载体的多糖结合疫苗,两者均能够刺激机体产生针对肺炎链球菌K5血清型CPS的特异性免疫反应。其中纳米疫苗尺寸通过透射电镜检测大小在25 nm左右,可诱导产生更高效价的Ig G抗体,且在致死性感染中保护率可达100%。为了评估结合疫苗所激发抗体的中和活性,通过在体外进行了调理吞噬实验。在补体和HL60细胞存在的情况下,C-CPS+Al组和CPS+Al组免后血清表现出对肺炎链球菌的调理吞噬活性,在原倍血清下,NP-OPS组杀伤了75%的肺炎链球菌,显著高于C-OPS+Al组和CPS+Al组(p技术将志贺氏菌纳米多糖结合疫苗通过经皮免疫的方式进行动物免疫效果评价,结果显示,与对照组相比,两个实验组均产生了高水平的Ig G抗体。在同样不添加佐剂的情况下,微针实验组比常规皮下注射组特异性抗体效价Ig G高出约8倍,两组的血清效价有显著性的差异(p技术相结合,成功地将志贺氏菌多糖展示于HBC-VLPs表面,并对其颗粒大小进行了检测,为33～45nm,符合纳米颗粒大小。结论:通过生物法制备了K5血清型以CTB为载体的结合疫苗和以CTBTri纳米颗粒NPs为载体的纳米结合疫苗,证明了两者均能够刺激机体产生针对肺炎链球菌K5血清型CPS的特异性免疫反应,且肺炎链球菌纳米结合疫苗在缺少佐剂的情况下,仍然能够产生高效的免疫反应,产生明显优于非纳米结合疫苗和单独多糖疫苗的保护效果,为肺炎链球菌的疫苗研发提供了新的选择方案。另外,针对前期已经制备的志贺氏菌纳米多糖结合疫苗,制备微针疫苗,通过经皮免疫的方式进行动物免疫,产生了比常规皮下注射方式更高效的免疫反应,为志贺氏菌疫苗的研发提供了新的思路。此外,本文制备以HBC病毒样颗粒为载体的志贺氏菌纳米多糖结合疫苗,将多糖抗原成功展示在HBC颗粒主要免疫显性区域(MIR),形成排列密集及重复的抗原表位,诱导机体产生免疫反应应答,为志贺氏菌纳米多糖疫苗的制备提供了一个新的纳米载体。

关键词：肺炎链球菌志贺氏菌微针 HBC-VLPs 蛋白多糖偶联技术结合疫苗

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