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稻米中蛋白体的分离纯化及其结构表征

稻米中蛋白体的分离纯化及其结构表征

作者：许子鑫安徽工程大学

学位级别：硕士

稻米作为全世界产量最高的谷物,是约三分之二人口的主粮,营养丰富。稻米富含淀粉,是人们饮食的主要能量来源。蛋白质是稻米中的第二大组分,具有较高的营养价值。稻米中的储藏蛋白主要以蛋白体的形式存在,淀粉以淀粉颗粒形式存在。尽管... 详细信息

稻米作为全世界产量最高的谷物,是约三分之二人口的主粮,营养丰富。稻米富含淀粉,是人们饮食的主要能量来源。蛋白质是稻米中的第二大组分,具有较高的营养价值。稻米中的储藏蛋白主要以蛋白体的形式存在,淀粉以淀粉颗粒形式存在。尽管有研究表明蛋白质含量高的稻米食用品质较低,但蛋白质对稻米中淀粉糊化及其食用品质的影响尚未有明确的结论。本文旨在从稻米中分离纯化蛋白体,并对其结构进行表征,为研究稻米中蛋白质对食用品质的影响提供方法学基础,也为研究蛋白质对淀粉糊化的影响提供新的途径。以蛋白质含量较高的糙米为原料,建立了通过稀碱法分离糙米中蛋白体的新方法,将所得蛋白体纯化,并对其进行结构进行表征。获得的主要结论如下:(1)糙米中蛋白体的分离及纯化。以糙米为原材料,建立利用稀碱(氢氧化钠)分离蛋白体的方法。在碱液浓度、液料比、搅拌时间、超声功率、超声温度和超声时间单因素实验的基础上,利用Box-Behnken响应面优化法获得了从糙米中分离蛋白体的较优条件为:碱液浓度14 mmol/L,液料比12 m L/g,搅拌时间90 min,超声功率90 W,超声温度35℃,超声时间40 min,此条件下分离混合物中蛋白体的体积分数为20.10%。将分离混合物离心,经0.10μm和5μm微孔滤膜过滤后,采用氯化钙去除残余淀粉,获得纯化的蛋白体。(2)糙米蛋白体的形态观察和结构表征。荧光显微镜和扫描电镜观察可见,所得蛋白体呈微球形,有荧光,大小在0.5μm-3.0μm之间。微孔滤膜过滤后,经氯化钙去除残余淀粉,所得糙米蛋白体均为离散的个体,彼此间不聚集;蛋白体表面有数个微孔,少数蛋白体表面可见单个较大的坑;蛋白体呈白色,不能被考马斯亮蓝染色。但微孔过滤后,若采用碳酸钠去除淀粉则所得蛋白体少部分呈聚集状态,且离散蛋白体的数量较少;说明碳酸钠去残余淀粉效果不好。由SDS-PAGE电泳可知,蛋白体具有16 k Da、22 k Da、33 k Da和57 k Da的蛋白亚基。XRD谱中19.9°处的衍射峰属于蛋白的β-折叠峰;FT-IR光谱中出现在1464 cm和1534 cm的吸收峰属于蛋白的Amide II带;拉曼光谱的散射峰出现在1303 cm和1651 cm,分别属于Amide III和Amide I带,上述均为蛋白质的特征峰。因此,采用稀碱分离法并经微孔滤膜和氯化钙纯化法从稻米中获取蛋白体是可行的,这为研究稻米胚乳中蛋白体的结构和性质及其对稻米食用品质形成的影响奠定了方法学基础。(3)精米中蛋白体的分离纯化及其结构表征。精米中蛋白质含量低于糙米,研究精白米中蛋白体的分离纯化方法,并对其结构进行初步表征,为研究蛋白质变化与稻米食用品质形成的关系奠定基础。在碱液浓度14 mmol/L,液料比12 m L/g,搅拌时间90 min,超声功率90 W,超声温度35℃,超声时间40 min条件下,从精米中分离出来的蛋白体大小也在0.5μm-3.0μm之间,精米经储藏后分离出来的蛋白体数量相对减少。XRD表明,精米蛋白体在19.9°处同样出现了属于蛋白质β-折叠的衍射峰,且精米储藏后分离出来的蛋白体的衍射峰更强,表明β-折叠增多。同时,从储藏后的精米分离出来的蛋白体出现在1642 cm附近的蛋白质酰胺I带红外吸收峰,要比从储藏前精米中分离出来的蛋白体的吸收峰更弱。以上研究结果说明,尽管糙米皮层中富集了蛋白体,导致精米中蛋白质含量较低,但从精米中分离蛋白体也是可行的。精米储藏后分离到的蛋白体数量更少,β-折叠增多,蛋白质酰胺I带红外吸收峰减弱。该研究结果为研究精米中蛋白质变化对食用品质形成的影响提供了可行性。综上所述,从糙米和精米中分离纯化蛋白体都是可行的,可以制备出供结构表征所需的蛋白体样品,这为进一步研究稻米中蛋白质对稻米食用品质形成的影响奠定了方法学基础。

关键词：稻米蛋白体分离纯化结构表征

蛋白体佐剂及用于鼠疫F1-V抗原的免疫效果

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第3期27卷 247-250页

作者：吴秀芳谢应国袁源王栋于三科王希良军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 西北农林科技大学动物科技学院

目的以蛋白体（proteosomes）佐剂，非共价结合鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原，探讨滴鼻免疫BALB／c小鼠后诱导的免疫应答和免疫保护效果。方法佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原非共价结合，滴鼻免疫BALB／c小鼠4次后，采用间接ELISA检测血... 详细信息

目的以蛋白体（proteosomes）佐剂，非共价结合鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原，探讨滴鼻免疫BALB／c小鼠后诱导的免疫应答和免疫保护效果。方法佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原非共价结合，滴鼻免疫BALB／c小鼠4次后，采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类，并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏液分泌型IgA；并用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。第4次免疫后7d，用100峨的鼠疫141强毒株进行腹腔攻毒。结果（1）以蛋白体为佐剂的鼠疫F1-V抗原与单纯的F1-V组相比，蛋白体疫苗组诱导血清IgG、IgA抗体显著升高（P〈0．01），同时蛋白体疫苗组能诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内多个黏膜部位特异性IgA抗体的产生，尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）；（2）蛋白体疫苗组主要引起IgG1型抗体，主要诱导TH2型免疫反应；（3）蛋白体疫苗组NALT和SP中CD^4＋/CD^8＋比值比PBS对照有显著增高（P〈0．01），MLN和PP中CD^4＋／CD^8＋比值与PBS对照差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）小鼠100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒后鼠疫F1-V重组蛋白组小鼠免疫保护率为0，而蛋白体佐剂疫苗组小鼠免疫保护率为67％。结论以自制的蛋白体为鼠疫F1-V抗原的佐剂滴鼻免疫小鼠，蛋白体不仅提高鼠疫F1-V抗原的系统免疫应答，而且能诱导小鼠呼吸道、消化道和生殖道局部黏膜免疫应答。蛋白体佐剂鼠疫疫苗对100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒具有一定的免疫保护作用，这为鼠疫黏膜疫苗的研制提供候选材料，也为鼠疫黏膜疫苗深入研究奠定了基础。

关键词：蛋白体鼠疫F1-V重组蛋白滴鼻免疫

小麦突变体AS208中Glu-B1位点缺失对籽粒中蛋白体形成和储藏蛋白合成与加工相关基因表达的影响

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作物学报 2017年第5期43卷 691-700页

作者：刘会云王婉晴李欣王轲王龙杜丽璞晏月明叶兴国中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程北京100081 首都师范大学生命科学学院北京100048 中国科学院遗传与发育生物学研究所/植物细胞与染色体工程国家重点实验室北京100101

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦籽粒贮藏蛋白的重要成分,其组成、表达和含量决定面团弹性和加工品质。本研究以Glu-B1位点上1Bx20和1By20双亚基沉默的小麦无性系变异体AS208为材料,以AS208的来源亲本轮选987作为对照,对AS208中Glu-B... 详细信息

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦籽粒贮藏蛋白的重要成分,其组成、表达和含量决定面团弹性和加工品质。本研究以Glu-B1位点上1Bx20和1By20双亚基沉默的小麦无性系变异体AS208为材料,以AS208的来源亲本轮选987作为对照,对AS208中Glu-B1位点的沉默机制和1Bx20、1By20亚基沉默对种子中蛋白体融合以及合成加工相关基因表达的影响进行了研究。Southern blot分析发现AS208比轮选987少2条特异带,染色体原位杂交(FISH)结果显示轮选987中有6条染色体出现杂交信号,而在AS208中有4条染色体出现杂交信号,表明AS208基因组中缺失Glu-B1位点。透射电镜观察发现,与轮选987相比,AS208的籽粒蛋白体形成过程,以及蛋白体大小和形状基本一致。qRT-PCR检测发现,在12个与籽粒蛋白质合成与加工相关基因中,有7个的表达模式两品种相似,有8个的表达量在AS208中高于在轮选987中,特别是Bip、PDI-1和PDI-5基因(高1.5~2.0倍)。本研究结果表明,小麦Glu-B1位点的基因对种子中蛋白体的形成没有明显影响,但一定程度上刺激了多数蛋白质合成和加工相关基因的表达,保证了种子内蛋白含量、蛋白体外形和大小基本不变,表现负反馈调节效应。

关键词：小麦高分子量谷蛋白亚基蛋白体转录因子分子伴侣

特用玉米营养品质与淀粉体和蛋白体发育关系的研究进展

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玉米科学 2019年第6期27卷 89-94页

作者：郑彦坤安庆师范大学生命科学学院

特用玉米是营养保健食品的重要原料,其营养品质仍待提高。胚乳淀粉体和蛋白体的发育状况与子粒直链淀粉、支链淀粉及醇溶蛋白含量密切相关。本文主要综述胚乳淀粉体和蛋白体发育的时空特征与相关基因突变对特用玉米营养品质的影响,展望... 详细信息

特用玉米是营养保健食品的重要原料,其营养品质仍待提高。胚乳淀粉体和蛋白体的发育状况与子粒直链淀粉、支链淀粉及醇溶蛋白含量密切相关。本文主要综述胚乳淀粉体和蛋白体发育的时空特征与相关基因突变对特用玉米营养品质的影响,展望未来研究趋势。

关键词：特用玉米营养品质淀粉体蛋白体

小麦强弱势粒胚乳淀粉体和蛋白体发育及物质积累研究

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麦类作物学报 2019年第1期39卷 89-95页

作者：汪巧菊陈昕钰冉莉萍李波董召娣余徐润熊飞扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225000 扬州大学广陵学院江苏扬州225000

为探明小麦强弱势粒发育的差异,以大穗型小麦品种宁麦13为材料,采用半薄切片、组织染色和生理生化测定等方法比较研究了小麦强弱势粒胚乳淀粉体和蛋白体的发育及物质积累过程。结果表明,在小麦颖果发育过程中,强势粒的形态大小始终大于... 详细信息

为探明小麦强弱势粒发育的差异,以大穗型小麦品种宁麦13为材料,采用半薄切片、组织染色和生理生化测定等方法比较研究了小麦强弱势粒胚乳淀粉体和蛋白体的发育及物质积累过程。结果表明,在小麦颖果发育过程中,强势粒的形态大小始终大于弱势粒,在花后3～11d表现尤为明显;与弱势粒相比,强势粒的胚乳尤其是背部胚乳中淀粉体和蛋白体的相对面积较大,充实度较高,胚乳质地更致密;强势粒的B型淀粉粒多于弱势粒,强、弱势粒的淀粉粒径分布均呈单峰型,强势粒中0～2μm的淀粉粒数显著高于弱势粒,在其他粒径范围两者无显著差异;与弱势粒相比,强势粒中总淀粉、蛋白质、醇溶蛋白、谷蛋白和支链淀粉含量均较高,而直链淀粉含量较低。由此可见,小麦弱势粒发育不良与胚乳淀粉体和蛋白体发育及物质积累密切相关。

关键词：小麦强弱势粒胚乳淀粉体蛋白体

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水稻强弱势粒间淀粉粒和蛋白体积累的差异

南京农业大学学报 2014年第1期37卷 15-20页

作者：张蕊丁艳锋李刚华王强盛刘正辉王绍华南京农业大学农业部南方作物生理生态重点开放实验室江苏南京210095

分别以同一稻穗第1天和第5天开花颖花为强势粒和弱势粒,测定了籽粒灌浆期间可溶性淀粉和粗蛋白的积累并用透射电镜观察胚乳细胞中的淀粉粒和蛋白体密度和大小的变化。结果表明:在籽粒灌浆初期,强弱势粒中都出现了少量单粒淀粉粒和极少... 详细信息

分别以同一稻穗第1天和第5天开花颖花为强势粒和弱势粒,测定了籽粒灌浆期间可溶性淀粉和粗蛋白的积累并用透射电镜观察胚乳细胞中的淀粉粒和蛋白体密度和大小的变化。结果表明:在籽粒灌浆初期,强弱势粒中都出现了少量单粒淀粉粒和极少数的蛋白体,并随着灌浆的进行,单粒淀粉粒逐渐发育形成复粒淀粉粒,淀粉粒和蛋白体的体积逐渐增大;到灌浆高峰期,强势粒中单粒淀粉粒、复粒淀粉粒和蛋白体同时大量存在,之后复粒淀粉粒逐步充实整个胚乳细胞,单粒淀粉粒和蛋白体随之减少,蛋白体的体积也有所减小;而弱势粒的表现则不同,随着籽粒灌浆的进行,复粒淀粉粒逐步增多,淀粉粒的体积也增大,但是单粒淀粉粒和蛋白体的数量一直不多。

关键词：水稻强势粒弱势粒淀粉粒蛋白体透射电镜

小麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成

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麦类作物学报 2009年第1期29卷 73-78页

作者：韦存虚张军周卫东陈义芳许如根扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009 扬州大学测试中心江苏扬州225009 扬州大学农学院江苏扬州225009

为给小麦品质育种提供参考,采用光学和电子显微镜技术系统观察了小麦品种扬麦12号胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成。结果表明,花后8 d的淀粉胚乳细胞开始出现贮藏蛋白颗粒。贮藏蛋白在粗内质网上合成后,有些经过高尔基体形... 详细信息

为给小麦品质育种提供参考,采用光学和电子显微镜技术系统观察了小麦品种扬麦12号胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成。结果表明,花后8 d的淀粉胚乳细胞开始出现贮藏蛋白颗粒。贮藏蛋白在粗内质网上合成后,有些经过高尔基体形成浓密小泡,有些直接在粗内质网腔中积累,脱离内质网形成蛋白体;浓密小泡和蛋白体进入蛋白贮藏液泡(PSV)。早期的蛋白体较小,呈球状;随着胚乳发育,蛋白体可以相互融合,扩大体积。后期的蛋白体相互融合形成蛋白质基质,单个蛋白体不再存在;接近成熟期的胚乳,胚乳细胞被贮藏物质淀粉粒和蛋白质基质所充实,蛋白质基质分布在淀粉粒之间的空隙内。试验结果说明,贮藏蛋白从内质网到PSV的转运有两种途径:依赖高尔基体途径和内质网衍生出蛋白体途径。

关键词：小麦胚乳发育贮藏蛋白蛋白体

大麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成

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作物学报 2009年第2期35卷 334-340页

作者：韦存虚张军周卫东陈义芳许如根扬州大学生物科学与技术学院扬州大学测试中心江苏省作物遗传生理重点实验室/扬州大学大麦研究所江苏扬州225009

利用光学显微镜和电子显微镜技术观察了大麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成。抽穗后8d的胚乳细胞,富含内质网和蛋白贮藏液泡(PSV),少量淀粉粒沿细胞核或细胞膜分布。贮藏蛋白颗粒在抽穗后10d的胚乳细胞中开始出现,内质网... 详细信息

利用光学显微镜和电子显微镜技术观察了大麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成。抽穗后8d的胚乳细胞,富含内质网和蛋白贮藏液泡(PSV),少量淀粉粒沿细胞核或细胞膜分布。贮藏蛋白颗粒在抽穗后10d的胚乳细胞中开始出现,内质网的腔膨大,积累贮藏蛋白,后脱离内质网形成蛋白体。在胚乳细胞生长分化早期,蛋白体呈球状进入PSV;随着胚乳发育,贮藏蛋白体急剧增多,以亚糊粉层细胞为主。在胚乳细胞生长分化中期,PSV充满蛋白体,其周围有电子致密物质;新产生的蛋白体在细胞质基质中呈球状聚集在一起。在胚乳细胞生长分化后期,PSV中的部分蛋白体或者细胞质基质中的部分蛋白体开始相互融合,同时内质网衍生出许多小蛋白体分散在淀粉粒之间。在胚乳发育成熟期,蛋白体相互融合形成无定形的蛋白质基质分布在淀粉粒间的间隙中。结果表明,大麦胚乳发育过程中,内质网衍生出蛋白体,聚集于PSV或细胞质基质中,然后相互融合形成成熟籽粒的蛋白质基质。

关键词：大麦胚乳贮藏蛋白蛋白体蛋白贮藏液泡

高、中、低筋力小麦胚乳不同部位蛋白体积累研究

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中国粮油学报 2014年第4期29卷 10-15页

作者：熊飞周亮余徐润王忠扬州大学生物科学与技术学院扬州225009

为探明不同面筋强度的小麦胚乳不同部位蛋白体积累的差异,本研究以徐麦30（高筋）、扬麦11（中筋）、扬麦13（低筋）小麦为试验材料,从微观结构角度研究了不同筋力小麦胚乳背部和腹部蛋白体大小、面积及积累的差异.结果表明：1）小麦胚... 详细信息

为探明不同面筋强度的小麦胚乳不同部位蛋白体积累的差异,本研究以徐麦30（高筋）、扬麦11（中筋）、扬麦13（低筋）小麦为试验材料,从微观结构角度研究了不同筋力小麦胚乳背部和腹部蛋白体大小、面积及积累的差异.结果表明：1）小麦胚乳腹部蛋白体积累速率呈现先慢后快的积累变化,不同筋力小麦表现为徐麦30＞扬麦11＞扬麦13,且在花后8、1 1和14 d达显著差异;2）花后11、14、17d为胚乳背部蛋白体的快速积累期,不同筋力小麦蛋白体积累量表现为徐麦30＞扬麦11＞扬麦13,尤以花后11、14和17 d突出;3）同一品种胚乳腹部和背部蛋白体积累量不同,表现为腹部＞背部,且差异显著;4）花后14～17 d是小麦胚乳积聚蛋白质速率最快的时期,细胞内合有较多的大蛋白体或蛋白聚积体且分布较集中;5）成熟籽粒中不同筋力小麦蛋白体和淀粉体分布不同.高筋小麦蛋白体分布较多,与淀粉粒结合程度最高,而低筋小麦蛋白体分布最少,且淀粉体之间空隙较大.中筋小麦蛋白体和淀粉体分布介于两者之间.

关键词：小麦腹位背部蛋白体积累