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蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

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浙江大学学报（理学版） 2020年第4期47卷 476-483页

作者：张赛南施柳佳廖志银王珍王首锋浙江大学基础医学系浙江杭州310058 绿城农科检测技术有限公司浙江杭州310052

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌... 详细信息

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势,由于目前生产的菌株表达量偏低,限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量,根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化,并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL,经遗传霉素G418抗性筛选后,获得了一株酵母转化子(G-pcoEWL),其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中,总蛋白浓度为607 mg·L-1,酶活达到677 U·mL-1。此外,本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到Sephadex G-50的分离效果更好,并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。

关键词：蛋清溶菌酶分泌表达毕赤酵母密码子

HPTS结合蛋清溶菌酶对枯草杆菌芽孢的灭活作用

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中国食品学报 2024年第3期24卷 112-121页

作者：辛伟山刘月李佳佳武思睿王旭娟王传发章中宁夏大学食品科学与工程学院银川750021

本文研究了高压热杀菌技术(HPTS)结合蛋清溶菌酶处理对枯草杆菌芽孢的杀灭作用。采用HPTS(200 MPa-25,65,75℃)结合蛋清溶菌酶(0.05%,0.1%,0.3%)保压处理20 min,处理后测定枯草杆菌芽孢的失活量、蛋白质与核酸的泄漏量、电导率、细胞膜N... 详细信息

本文研究了高压热杀菌技术(HPTS)结合蛋清溶菌酶处理对枯草杆菌芽孢的杀灭作用。采用HPTS(200 MPa-25,65,75℃)结合蛋清溶菌酶(0.05%,0.1%,0.3%)保压处理20 min,处理后测定枯草杆菌芽孢的失活量、蛋白质与核酸的泄漏量、电导率、细胞膜Na^(+)/K^(+)-ATPase活性变化、芽孢的形态结构变化、蛋白质二级结构稳定性变化、内膜通透性变化。结果表明,HPTS结合溶菌酶对芽孢具有明显的协同杀灭作用,200 MPa/75℃结合0.3%溶菌酶处理后,芽孢存活浓度下降3.91 lg(CFU/mL)。HPTS结合溶菌酶处理后芽孢蛋白质、核酸泄漏量及上清液电导率都显著增加,Na^(+)/K^(+)-ATPase活性显著降低,芽孢蛋白质稳定性下降,芽孢表面显示出极度的粗糙,伴随着严重的塌陷皲裂,结构发生了明显变化。流式细胞术分析发现,芽孢内膜的通透性显著增加。结论:HPTS结合蛋清溶菌酶处理抑制了芽孢代谢途径中关键酶的活性,同时破坏了枯草杆菌芽孢的芽孢壁、内膜等结构,改变了芽孢的生理特性,最终导致芽孢失活。

关键词： HPTS 蛋清溶菌酶杀菌芽孢细胞结构

蛋清溶菌酶淀粉样纤维对人神经母细胞瘤细胞的毒性

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畜牧兽医学报 2022年第8期53卷 2721-2728页

作者：白瑜王武王碧李颖冯自立陕西理工大学生物科学与工程学院陕西省资源生物重点实验室汉中723000

本研究旨在探讨一定理化条件下形成的蛋清溶菌酶淀粉样纤维对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的毒性作用。采用高温(57±0.1)℃、pH 2.0甘氨酸溶液、振荡条件下孵育100μmol·L^(-1)的蛋清溶菌酶蛋白,使其聚集成为蛋清溶菌酶淀粉样纤维;透... 详细信息

本研究旨在探讨一定理化条件下形成的蛋清溶菌酶淀粉样纤维对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的毒性作用。采用高温(57±0.1)℃、pH 2.0甘氨酸溶液、振荡条件下孵育100μmol·L^(-1)的蛋清溶菌酶蛋白,使其聚集成为蛋清溶菌酶淀粉样纤维;透射电子显微镜观察蛋清溶菌酶淀粉样纤维的超微结构,ANS荧光法测定纤维的疏水性,圆二色谱法测定并计算纤维的二级结构含量;将此纤维作用于培养的SH-SY5Y神经细胞,MTT法检测细胞活力,核染色法检测细胞凋亡状况。透射电镜结果显示,蛋清溶菌酶在孵育4d后形成了呈短杆状超微结构的淀粉样纤维;与天然蛋清溶菌酶蛋白相比,纤维的疏水性和二级结构β折叠含量均显著提高;且1~3μmol·L^(-1)纤维作用于SH-SY5Y细胞12、24和48h均产生了显著的毒性作用(P蛋清溶菌酶在一定理化条件下可形成具有神经细胞毒性的淀粉样纤维,为解释朊蛋白或其他蛋白质形成淀粉样纤维的机制提供参考。

关键词：淀粉样纤维蛋清溶菌酶 β折叠人神经母细胞瘤细胞

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蛋清溶菌酶对枯草芽孢杆菌芽孢萌发的影响

食品工业科技 2008年第11期29卷 213-216页

作者：白艳红赵电波杨公明吴小强毛多斌张文叶郑州轻工业学院食品与生物工程学院河南郑州450002 华南农业大学食品学院广东广州510642

研究了在不同培养温度下溶菌酶对枯草芽孢杆菌芽孢萌发的抑制作用。溶菌酶浓度为0.5mg/mL,采用胰蛋白胨大豆营养肉汤培养基进行培养,用稀释平板计数法测定36h内的生长曲线。结果表明:在33℃条件下添加溶菌酶的处理组的迟滞期比对照组延... 详细信息

研究了在不同培养温度下溶菌酶对枯草芽孢杆菌芽孢萌发的抑制作用。溶菌酶浓度为0.5mg/mL,采用胰蛋白胨大豆营养肉汤培养基进行培养,用稀释平板计数法测定36h内的生长曲线。结果表明:在33℃条件下添加溶菌酶的处理组的迟滞期比对照组延长了8h,传代时间延长了15min;在25℃条件下,处理组的迟滞期比对照组延长了10h,传代时间延长了12min。到达稳定期后,处理组的菌落总数始终低于对照组水平。在10℃条件下,对照组芽孢的萌发也经历了较长的迟滞期,传代时间延长至194min;但在36h内处理组始终没有观察到芽孢萌发后的指数生长期,芽孢一直处于被抑制的状态。研究结果表明,溶菌酶对枯草芽孢杆菌芽孢的萌发具有明显的抑制作用,而且在低温条件下溶菌酶仍然具有抑菌活性。

关键词：蛋清溶菌酶抑菌芽孢萌发

蛋清溶菌酶与渗透剂对大肠杆菌的协同抑菌作用

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食品科学 2011年第11期32卷 176-180页

作者：尹金凤史锋王小元江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为了提高溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌性能,研究蛋清溶菌酶和渗透剂甘氨酸、EDTA-Na2复配对大肠杆菌ATCC25922、DH5α的抑菌效果,及细胞外膜渗透性和细胞表面形态的变化。结果表明:大肠杆菌ATCC25922对溶菌酶的敏感性明显强于DH5α,其外... 详细信息

为了提高溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌性能,研究蛋清溶菌酶和渗透剂甘氨酸、EDTA-Na2复配对大肠杆菌ATCC25922、DH5α的抑菌效果,及细胞外膜渗透性和细胞表面形态的变化。结果表明:大肠杆菌ATCC25922对溶菌酶的敏感性明显强于DH5α,其外膜渗透性也高于大肠杆菌DH5α。当溶菌酶分别和渗透剂甘氨酸或EDTA-Na2复配后,对大肠杆菌ATCC25922和DH5α的抑菌性能都显著提高;三者共同作用时,对大肠杆菌ATCC25922的抑菌能力从101.0提高到103.45,对大肠杆菌DH5α则从100.35提高到103.15,表现出协同抑菌作用。细胞外膜渗透性的N-苯基-1-萘胺(NPN)测定结果表明:溶菌酶与甘氨酸、EDTA-Na2复配后,两种大肠杆菌的外膜渗透性相应提高,TEM电镜结果也证实溶菌酶与渗透剂对大肠杆菌细胞表面有协同破坏作用。因此改善大肠杆菌的外膜渗透性有助于增强溶菌酶对其抑菌效果。

关键词：蛋清溶菌酶甘氨酸 EDTA-Na2 大肠杆菌外膜渗透性

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蛋清溶菌酶的重组合成及生化特性研究

蛋清溶菌酶的重组合成及生化特性研究

作者：刘志军陕西科技大学

学位级别：硕士

溶菌酶是广泛存在于微生物、动植物和人体中的一类水解酶,能够破坏细菌细胞壁,造成细菌裂解死亡。其中,蛋清溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素,减少细菌耐药性带来的危害,在食品、医药和畜牧养殖等行业中应用广泛。目前市售的蛋清溶菌... 详细信息

溶菌酶是广泛存在于微生物、动植物和人体中的一类水解酶,能够破坏细菌细胞壁,造成细菌裂解死亡。其中,蛋清溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素,减少细菌耐药性带来的危害,在食品、医药和畜牧养殖等行业中应用广泛。目前市售的蛋清溶菌酶主要通过化学手段从蛋清中提取,其收率较低。利用微生物合成蛋清溶菌酶是一种高效、经济的生产方式。本论文以毕赤酵母作为宿主菌株,构建高活力蛋清溶菌酶重组表达菌株,进一步利用5 L发酵罐提高其产量与活性,并对重组酶的生化特性进行研究。本研究首先根据毕赤酵母的密码子偏好性,对蛋清溶菌酶基因进行密码子优化,利用重组表达载体pPIC9K及毕赤酵母菌株GS115,构建蛋清溶菌酶的诱导分泌型重组表达系统,利用缺组氨酸MD平板和G418抗性筛选后获得阳性转化子,进一步进行诱导表达测试,在发酵上清中检测出有活性的重组蛋清溶菌酶。其次,本研究通过不同转化子的活性收率筛选,获得了活性收率最优的工程菌株,最高可达665 U/mL,与未经筛选的对照菌株相比活性收率提高了 3.02倍。进一步利用5 L发酵罐进行发酵优化,OD600最高达到了 250,活性收率达到了 2000 U/mL,与摇瓶培养相比,活性收率提高了3倍。本研究对重组蛋清溶菌酶的粗酶液进行生化特性分析,结果表明其热稳定性较强,在90℃加热30 min仍能保持50%的活性;最适pH为6.0,在pH 5.0-9.0的范围内能够保持60%以上的活性;对盐浓度和金属离子敏感,且呈浓度依赖性。这些特性与天然蛋清溶菌酶接近。本研究进一步对粗酶液进行纯化,所得酶液的比酶活为6128 U/mg,与纯化前相比提高了9.9 倍。综上,本研究成功构建了能够分泌表达蛋清溶菌酶的重组毕赤酵母菌株,并实现了 5 L发酵罐的放大培养,获得了产量高、活性好的重组蛋清溶菌酶,且粗酶液的生化性质与天然酶相近。该研究可为蛋清溶菌酶的微生物工业生产提供理论支持和参考。

关键词：蛋清溶菌酶毕赤酵母重组表达高密度发酵生化特性

蛋清溶菌酶稀释复性过程中集聚体和中间态的研究

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蛋清溶菌酶稀释复性过程中集聚体和中间态的研究

作者：梁长利西北大学

学位级别：硕士

本文以溶菌酶为模型蛋白研究了蛋白质的复性机理。用荧光相图法研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程的中间态,用阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效凝胶排阻层析法(SEC)研究了蛋清溶菌酶稀释... 详细信息

本文以溶菌酶为模型蛋白研究了蛋白质的复性机理。用荧光相图法研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程的中间态,用阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效凝胶排阻层析法(SEC)研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程形成的集聚体。本研究结果为探索蛋白质折叠机理提供了有益的帮助。在用荧光相图法研究脲和盐酸胍诱导去折叠蛋清溶菌酶的折叠过程中发现:当去折叠体系中有还原剂β-巯基乙醇时,还原变性溶菌酶的稀释复性过程中都没有中间态产生,符合典型的“二态模型”;当去折叠体系中没有还原剂存在时,变性溶菌酶的稀释复性过程中都会产生两个中间态,符合“四态模型”。当用复性缓冲液稀释还原脲变性溶菌酶时,会迅速产生可观量的沉淀。上清液和沉淀的非还原SDS-PAGE结果表明还原脲变性溶菌酶除了能直接复性成天然态溶菌酶分子外,还能在上清液中形成溶菌酶分子三聚体,同时在沉淀中形成溶菌酶分子二聚体。上清液的SEC分析结果也验证了上清液中含有溶菌酶分子三聚体。上清液和沉淀的还原SDS-PAGE结果表明,二聚体和三聚体主要是还原脲变性溶菌酶分子通过分子间二硫键错配形成的。同时沉淀的阴极PAGE电泳和在复性过程中加入SDS的复性结果表明复性过程中形成的二聚体是可溶的,可溶的溶菌酶分子二聚体之间通过非共价键相互作用形成了溶菌酶分子四聚体沉淀。非还原脲变性溶菌酶稀释复性液的非还原SDS-PAGE结果表明当溶菌酶浓度小于7.0mg/mL时,复性过程中不会形成集聚体;而当溶菌酶浓度大于7.0mg/mL时,复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。复性液的阴极PAGE表明,当溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时,复性过程中不会形成集聚体;而当溶菌酶浓度大于4.0mg/mL时,复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。同时,复性液的SEC结果也证实了非还原脲变性蛋清溶菌酶在复性过程中产生了溶菌酶分子二聚体和三聚体。综合以上实验结果可以得出以下结论:(Ⅰ)还原脲和盐酸胍变性溶菌酶的稀释复性过程中没有中间态产生,它们的复性过程均为“二态过程”。还原脲变性

关键词：蛋清溶菌酶稀释复性荧光相图中间态集聚体

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蛋清溶菌酶抗菌肽的制备及其抑菌性研究

蛋清溶菌酶抗菌肽的制备及其抑菌性研究

作者：闫哲贤天津科技大学

学位级别：硕士

蛋清溶菌酶是一种广泛存在于生物体中、安全性高、具有抗菌活性的碱性蛋白酶,常用作食品的防腐剂和保鲜剂。但是,溶菌酶属于非广谱抗菌剂,只能够有效地杀死革兰氏阳性菌（G+）,对革兰氏阴性菌（G-）的作用效果不显著。蛋清溶菌酶是一种... 详细信息

蛋清溶菌酶是一种广泛存在于生物体中、安全性高、具有抗菌活性的碱性蛋白酶,常用作食品的防腐剂和保鲜剂。但是,溶菌酶属于非广谱抗菌剂,只能够有效地杀死革兰氏阳性菌（G+）,对革兰氏阴性菌（G-）的作用效果不显著。蛋清溶菌酶是一种具有免疫原性的蛋白质,并且,在中性和碱性的条件下热稳定性极差。酶解可以有效地解决上述问题。本课题采用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对溶菌酶进行双酶解,对酶解产物的抑菌活性和热稳定性进行探究,再对其进行分离纯化,得到抑菌活性最强的抗菌肽,并对抗菌肽的抑菌机理进行初步探究,主要试验结果如下:首先,在酶最适反应条件下,用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对溶菌酶进行双酶解,得到双酶解产物Lyz-pp。双酶解产物失去全部酶活性,分子量主要分布在1000～5000 Da范围内,初步降低其免疫原性。双酶解产物的抗菌谱与蛋清溶菌酶基本一致,都对革兰氏阳性菌有良好的抑菌效果,对革兰氏阴性菌效果不显著,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别是1.25 mg/mL和2.5 mg/mL。在不同pH条件下,双酶解产物的热稳定性要强于溶菌酶和Nisin,但是随着pH的升高出现下降趋势。其次,通过Sephadex G-25凝胶层析柱,HiTrap SP HP阳离子交换柱以及制备型RP-HPLC三步对双酶解产物进行分离纯化,得到抗菌活性最强的抗菌肽F-2-3-1。抗菌肽经MALDI-TOF-MS得到单一峰,测得分子量为1418.2 Da,经LC-MC/MC鉴定和分析得到其氨基酸序列为KKIVSDGNGMNAW,对应蛋清溶菌酶N端第96-108位氨基酸残基。抗菌肽比双酶解产物具有更好的热稳定性,并且扩大了其抑菌谱,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.312 mg/mL和0.615 mg/mL,对大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌浓度均为1.25 mg/mL。最后,对抗菌肽F-2-3-1的抑菌机理做了初步探究。经过抗菌肽处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞形态发生严重变形,细胞膜表面凹陷,出现孔洞,大肠杆菌的表面疏水性随着抗菌肽浓度的升高而降低,细胞外膜和内膜通透性都变大,细胞内K+出现外泄,说明抗菌肽是通过膜损伤机制在发挥作用。

关键词：蛋清溶菌酶酶解抗菌肽抑菌活性抑菌机理

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溶液流动对蛋清溶菌酶晶体生长的作用

生物物理学报 1991年第3期7卷 422-423页

作者：刘山,肖雯,周尧和西北工业大学凝固技术国家实验室西北工业大学凝固技术国家实验室西北工业大学凝固技术国家实验室西安西安西安

蛋白质结晶学的不断发展,使得蛋白质三维结构的测定成为现实,为药物设计、蛋白质工程,生物电子技术的发展奠定了基础.目前遇到的最大问题在于如何培养适合于结构分析的大尺寸优质单晶.近年来,来自包括蛋白质晶体学、生物物理学、生物化... 详细信息

蛋白质结晶学的不断发展,使得蛋白质三维结构的测定成为现实,为药物设计、蛋白质工程,生物电子技术的发展奠定了基础.目前遇到的最大问题在于如何培养适合于结构分析的大尺寸优质单晶.近年来,来自包括蛋白质晶体学、生物物理学、生物化学以及凝固科学的研究者都投入了大量的精力,研究的重点集中在蛋白质晶体的形核和生长机制.本文定性考察了溶液流动对溶菌酶晶体生长速度的影响.实验选用的是北京生物物理所生产的电泳纯蛋清溶菌酶,母液的浓度为:3%Lysozyme+4.5%NaCl,pH=7.0,采用

关键词：晶体生长蛋清溶菌酶单晶晶形