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蛇床子素抑制NF-κB和p38/MAPK改善糖尿病诱导的肾脏损伤

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中国临床药理学与治疗学 2022年第6期27卷 622-631页

作者：金依依周科挺杨成成徐萍朱素燕宁波市第一医院药学部浙江宁波315010

目的:研究蛇床子素(osthole)对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病(T1DM)小鼠的治疗作用,并探讨其相关机制。方法:构建STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型,将小鼠随机分为正常对照组、STZ模型组和STZ+osthole组(20 mg/kg)。观察各组小鼠体质量、... 详细信息

目的:研究蛇床子素(osthole)对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病(T1DM)小鼠的治疗作用,并探讨其相关机制。方法:构建STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型,将小鼠随机分为正常对照组、STZ模型组和STZ+osthole组(20 mg/kg)。观察各组小鼠体质量、血糖、尿蛋白、尿素氮和肌酐以检测肾脏功能。H&E染色和PAS染色检测肾脏组织损伤程度,Sirius Red染色检测肾脏纤维化程度。CD68和F4/80免疫荧光染色观察肾脏组织巨噬细胞浸润情况,RT-qPCR检测肾脏组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA表达水平,Western blot检测磷酸化的核因子κB p65(nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B alpha,IκBα)、p-IκBα和磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38(p-p38)的蛋白相对表达水平。结果:与STZ模型组相比,在蛇床子素治疗后,尿蛋白、尿素氮、肌酐和肾重/体重均显著降低(P蛇床子素可有效改善糖尿病诱导的肾脏损伤,该保护作用可能与其抑制NF-κB和p38/MAPK信号通路有关。蛇床子素可能成为防治糖尿病相关肾脏损伤的潜在药物。

关键词：蛇床子素糖尿病肾病炎症 NF-κB p38/MAPK

蛇床子素对Monilinia fructicola的生物活性及抑菌机制初探

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蛇床子素对Monilinia fructicola的生物活性及抑菌机制初探

作者：顾桂飞贵州大学

学位级别：硕士

近年来贵州省李产业发展迅速,已成为助推乡村振兴的主要水果产业之一。褐腐病是能侵染李果实整个生长阶段的重要病害,目前防治主要以化学防治为主,但化学药剂大量使用易带来病原菌抗药性增强、水果农药残留及环境污染等一系列问题,因此... 详细信息

近年来贵州省李产业发展迅速,已成为助推乡村振兴的主要水果产业之一。褐腐病是能侵染李果实整个生长阶段的重要病害,目前防治主要以化学防治为主,但化学药剂大量使用易带来病原菌抗药性增强、水果农药残留及环境污染等一系列问题,因此寻找替代防治方案势在必行。蛇床子素属于香豆素类化合物,常作为中药被广泛应用于治疗人体各种疾病,目前在生产上作为杀虫剂和杀菌剂登记使用,其毒性相对安全。但蛇床子素对李褐腐病菌的生物活性及作用机制尚未见报道。本研究在分离李褐腐病致病菌基础上,测定了蛇床子素对该菌体外毒力以及体内接种抑制活性,研究了蛇床子素对李褐腐病菌菌丝形态、超微结构、细胞膜透性和主要成分以及细胞壁相关酶活等的影响,并开展了蛇床子素及其配方组合对李褐腐病的田间药效和果实品质评估,旨为蛇床子素在李生产上推广应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.明确了引起贵州李褐腐病的致病菌为Monilinia fructicola。从贵州李主产区镇宁县、修文县、惠水县、开阳县和播州区等种植基地采集酥李、脆红李、蜂糖李、奈李、玫瑰李等李果实褐腐病样品,采用组织分离法,经分离纯化后得到KYCH、XWCH、HSMG、ASFT-1、ASFT-2、HSFT、KYSL、KYNL和KYT共9株代表菌株,经过形态学鉴定,结合分子生物学分析,将引起贵州李褐腐病的致病菌鉴定为美澳型核果链核盘菌M.fructicola。2.筛选了对M.fructicola具有较好抑制作用的杀菌剂。采用菌丝生长速率法、孢子萌发法以及活体接种法研究了杀菌剂对M.fructicola(ASFT-2)的抑制活性。结果显示,植物源农药中蛇床子素对M.fructicola的抑制作用最强,对菌丝生长比孢子萌发更为敏感,其抑制菌丝生长的EC为11.6140μg/m L,MIC为50μg/m L。活体接菌后,蛇床子素对李褐腐病病斑扩展具有良好的抑制作用,且保护作用优于治疗作用。麦角甾醇合成抑制剂DMIs戊唑醇和丙硫菌唑对M.fructicola菌丝的抑制作用较好,其EC值分别为0.0676μg/m L和0.0686μg/m L;通过二元复配,发现蛇床子素与丙硫菌唑按1:6复配对M.fructicola菌丝生长的抑制作用最佳,其EC为0.0551μg/m L,共毒系数为145.10。3.揭示了蛇床子素损伤M.fructicola细胞壁的生化机制。设置蛇床子素0.5MIC、MIC和2MIC 3种浓度处理,测定M.fructicola菌丝形态、超微结构、细胞膜透性及主要成分和细胞壁相关酶活等指标的变化。结果发现,蛇床子素能减少菌丝干物质形成,2MIC处理抑制率达100%;同时还能影响菌丝对细胞壁的穿透力,2MIC处理后的菌丝几乎无穿透能力;扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察发现,蛇床子素可引起M.fructicola菌丝皱缩扭曲,细胞壁和细胞膜部分消融,细胞器溶解,细胞内容物外泄。进一步测定相对电导率和PI染色观察,发现在短时间内蛇床子素处理对细胞膜完整性和通透性影响较小,对麦角甾醇的含量也无显著影响;但蛇床子素处理后M.fructicola菌丝体内几丁质酶活性显著升高,β-1,3-葡聚糖酶活性无显著变化,因此推测蛇床子素通过提高几丁质酶活性,损伤M.fructicola细胞壁,达到抑制效果。4.探明了蛇床子素及其复配组合对蜂糖李褐腐病的防治效果。试验结果表明,1%蛇床子素EW处理7 d和14 d后对李褐腐病的防效分别为47.25%和45.34%,1%蛇床子素EW与30%丙硫菌唑OD复配增效组合(1:6)处理7 d和14 d后的防效分别达77.11%和80.29%,且可使果实横纵径增加,显著提高维生素C、可溶性糖、可溶性蛋白和可溶性固形物含量,在一定程度上改善李果实营养品质,保持了蜂糖李独有的风味和口感。

关键词： Monilinia fructicola 蛇床子素生物活性抑菌机理

蛇床子素对糖尿病肾病模型小鼠肾间质纤维化的预防作用

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中国药房 2022年第22期33卷 2719-2723页

作者：黄倩郑丹丹黄秋虹施子禄泉州医学高等专科学校基础医学部生理教研室福建泉州362100 福建医科大学附属泉州第一医院肾内科福建泉州362000

目的探讨蛇床子素(OST)对糖尿病肾病(DN)模型小鼠肾间质纤维化的影响。方法采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型,成功后继续喂养12周建立DN模型。将糖尿病模型小鼠分为模型组和OST低、中、高剂量(20、40、80 mg/kg)组,每... 详细信息

目的探讨蛇床子素(OST)对糖尿病肾病(DN)模型小鼠肾间质纤维化的影响。方法采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型,成功后继续喂养12周建立DN模型。将糖尿病模型小鼠分为模型组和OST低、中、高剂量(20、40、80 mg/kg)组,每组10只,糖尿病造模成功后每日灌胃相应药物或溶剂(模型组)1次,持续12周;同时设置正常对照组。末次灌胃后,检测各组小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮水平;Masson染色法观察肾间质区域胶原纤维的沉积情况;免疫组化染色法检测肾皮质中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达;Western blot法检测肾皮质中卵泡抑素样蛋白1(Fstl1)、锌指转录因子1(Snail1)蛋白表达和蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平(以p-Akt/Akt比值计)。结果与正常对照组比较,模型组小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr、尿素氮水平,肾间质胶原纤维沉积占比,肾皮质中vimentin表达水平以及Fstl1、Snail1蛋白表达水平和p-Akt/Akt比值均显著升高(P<0.01),E-cadherin表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,OST各剂量组小鼠上述指标变化均显著逆转(P<0.05或P<0.01)。结论OST预防性用药可有效降低DN模型小鼠的空腹血糖,保护其肾功能,抑制肾小管上皮细胞间充质转分化,延缓肾间质纤维化进程,其作用机制可能与抑制Fstl1/Akt/Snail1通路有关。

关键词：蛇床子素糖尿病肾病间质纤维化卵泡抑素样蛋白1 蛋白激酶B 锌指转录因子1 小鼠

蛇床子素调控LncRNA SNHG5对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

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中国老年学杂志 2023年第4期43卷 946-950页

作者：周璇胡苏华随州市中心医院中医科湖北随州441300 随州市中心医院神经内科一病区湖北随州441300

目的探讨蛇床子素对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡、炎症反应的影响及其对长链非编码RNA(LncRNA)SNHG5的调控作用。方法采用高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2建立细胞损伤模型,用不同浓度的蛇床子素处理HK-2细胞;pcDNA、pcDNA-SNHG... 详细信息

目的探讨蛇床子素对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡、炎症反应的影响及其对长链非编码RNA(LncRNA)SNHG5的调控作用。方法采用高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2建立细胞损伤模型,用不同浓度的蛇床子素处理HK-2细胞;pcDNA、pcDNA-SNHG5转染HK-2细胞后加入30 mmol/L葡萄糖处理细胞;si-NC、si-SNHG5分别转染HK-2细胞后加入100 nmol/L蛇床子素与30 mmol/L葡萄糖的处理细胞;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SNHG5的表达量;采用CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞活力、凋亡率;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的水平。结果蛇床子素处理高糖诱导的HK-2细胞后可明显提高SNHG5的表达水平,明显增强细胞活力,而明显降低凋亡率、TNF-α、IL-6的水平(P蛇床子素联合处理高糖诱导的HK-2细胞后细胞活力明显降低,而凋亡率、TNF-α、IL-6水平明显升高(P蛇床子素可通过促进SNHG5的表达增强细胞增殖能力而抑制细胞凋亡及炎症反应从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。

关键词：蛇床子素 LncRNA SNHG5 肾小管上皮细胞增殖凋亡炎症

蛇床子素通过PI3K/Akt/mTOR通路对糖尿病肾病大鼠纤维化及HSP90、SIRT1的影响

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中国老年学杂志 2023年第6期43卷 1446-1450页

作者：王晓伟余小柱郭二霞王会霞高华山平顶山学院河南平顶山467092 平顶山市中医院平顶山市第五人民医院

目的研究蛇床子素对糖尿病肾病大鼠磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)信号通路对及热休克蛋白(Hsp)90、沉默信息调节因子(SIRT)1的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为5组:模型组和灌胃蛇床子素1... 详细信息

目的研究蛇床子素对糖尿病肾病大鼠磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)信号通路对及热休克蛋白(Hsp)90、沉默信息调节因子(SIRT)1的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为5组:模型组和灌胃蛇床子素1、10、20和50 mg/(kg·d)组,正常组和模型组分别给予相同体积的生理盐水。于给药8 w后,测定大鼠血糖变化和24 h尿微量白蛋白;取血检测大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN),并计算肌酐清除率(Ccr)。采用RT-聚合酶链反应(PCR)检测大鼠肾脏组织SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA及蛋白表达情况;观察大鼠肾脏组织病理变化;采用Western印迹法测定纤维化相关蛋白:肾脏Ⅳ型胶原蛋白、纤联蛋白(FN)和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(TIMP)-1、MMP-9及PI3K、Akt蛋白表达。结果模型组血糖、尿微量白蛋白、Scr、BUN、PI3K、Akt、肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN和TIMP-1水平均显著高于正常组(P0.05)。与正常组相比模型组肾小球肥大,肾小球数量增加,伴有肾小球系膜扩张和基底膜厚度增加,肾小管有空泡变形。治疗组肾小球肥大、增生及系膜扩张和基底膜变后现象均较轻,其中高剂量治疗组改善最显著。结论蛇床子素可以降低糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白,降低肾组织病理损伤,可能与PI3K/Akt/mTOR通路有关,且可以上调SIRT1表达水平,降低肾纤维化,对HSP90表达水平无明显关系。

关键词：蛇床子素磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)通路沉默信息调节因子(SIRT)1 纤维化热休克蛋白(Hsp)90

苦参碱和蛇床子素复配对草莓二斑叶螨杀螨活性的影响

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中国生物防治学报 2022年第4期38卷 1037-1042页

作者：张质斌呼倩杜相革中国农业大学植物保护学院北京100193

研发一种高效、安全、环保的植物源杀螨剂配方,本文选取两种对二斑叶螨具有较好杀螨活性的植物源药剂——苦参碱和蛇床子素。通过毒力比和孙云沛法筛选最佳的复配比例,并进行盆栽试验。结果表明:苦参碱和蛇床子素两种单剂的LC_(50)分别... 详细信息

研发一种高效、安全、环保的植物源杀螨剂配方,本文选取两种对二斑叶螨具有较好杀螨活性的植物源药剂——苦参碱和蛇床子素。通过毒力比和孙云沛法筛选最佳的复配比例,并进行盆栽试验。结果表明:苦参碱和蛇床子素两种单剂的LC_(50)分别为1770.504mg/L和1898.148mg/L。将苦参碱和蛇床子素按照有效成分比为1:4.29进行复配,该复配药剂的LC_(50)为1276.656 mg/L,共毒系数为146.6(大于100),增效作用最明显。经盆栽验证试验,药后1 d、3 d、5 d、7 d,复配药剂的校正防效均高于10%苦参碱和11.35%蛇床子素单剂,药后7d差异显著,药剂的持效期延长,对开发苦参碱和蛇床子素复配药剂防治二斑叶螨提供了理论依据。

关键词：二斑叶螨苦参碱蛇床子素复配

蛇床子素衍生物的结构、合成与生物活性研究进展

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中国药物化学杂志 2022年第4期32卷 314-322页

作者：罗宗源任丹刘思言杜波钱珊西华大学食品与生物工程学院四川成都610039 成都新朝阳作物科学有限公司四川成都611630

蛇床子素是从植物蛇床子中提取得到的活性物质,属于香豆素类,其核心结构由苯环与吡喃酮环组成。蛇床子素具有广泛的生物活性且不存在明显的毒副作用,目前已报道其具有保护神经系统、保护心脏和循环系统、抗炎、抗肿瘤、抗骨质疏松、驱... 详细信息

蛇床子素是从植物蛇床子中提取得到的活性物质,属于香豆素类,其核心结构由苯环与吡喃酮环组成。蛇床子素具有广泛的生物活性且不存在明显的毒副作用,目前已报道其具有保护神经系统、保护心脏和循环系统、抗炎、抗肿瘤、抗骨质疏松、驱虫杀菌等功效,在医学和农业领域具有一定的研究价值。然而,蛇床子素及其衍生物的合成收率非常低,主要通过从天然产物中提取获得,但提取效率有限且不利于资源可持续发展。本文综述了近年来蛇床子素及其衍生物的结构、合成方法与生物活性,旨为其在医药和农药领域的研究提供参考。

关键词：蛇床子素结构修饰生物活性构效关系香豆素

蛇床子素通过ROS/NF-κB信号通路诱导舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的研究

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蛇床子素通过ROS/NF-κB信号通路诱导舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的研究

作者：韩曦缘锦州医科大学

学位级别：硕士

目的探究蛇床子素(Osthole,OST)对人舌鳞癌Cal-27细胞增殖与凋亡的作用,并探究其具体的信号通路。方法1、MTT法检测OST对Cal-27细胞的增殖抑制作用,采用IC50浓度进行后续实验,并将细胞分为对照组与OST组。2、克隆形成实验检测OST对Cal-2... 详细信息

目的探究蛇床子素(Osthole,OST)对人舌鳞癌Cal-27细胞增殖与凋亡的作用,并探究其具体的信号通路。方法1、MTT法检测OST对Cal-27细胞的增殖抑制作用,采用IC50浓度进行后续实验,并将细胞分为对照组与OST组。2、克隆形成实验检测OST对Cal-27细胞克隆形成能力的影响。3、Hoechst 33342染色及流式细胞术检测OST对Cal-27细胞凋亡的影响。4、Western blot检测加药后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及NF-κB通路关键蛋白p65、IκB-α、IKKβ表达情况。5、二氢乙锭(DHE)染色检测各组Cal-27细胞活性氧(ROS)水平。6、采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),将细胞进一步分为对照组、NAC对照组、NAC预处理组和OST组;DHE法按此分组检测各组Cal-27细胞ROS水平;并对实验3进行重复实验;Western blot检测每组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、NF-κB通路关键蛋白p65、IκB-α、IKKβ及抗氧化蛋白HO-1、Nrf2表达情况。结果1、MTT实验表明,OST能够抑制Cal-27细胞的增殖,加药组细胞比对照组细胞活力明显降低(P<0.01),其48h半数抑制浓度(IC50)为76.6μmol·L-1。2、克隆形成实验说明Cal-27细胞克隆形成能力经加药处理后明显降低(P<0.01)。3、Hoechst 33342染色后观察到加药组带有白蓝色荧光典型凋亡形态细胞增多,Annexin V-FITC/PI染色后可见加药组细胞凋亡率较对照组细胞相比有明显升高(P<0.01)。4、Western blot结果表明加药组细胞中凋亡蛋白Bax表达增多、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少;NF-κB通路蛋白p65、IκB-α、IKKβ磷酸化减低(P<0.01)。5、DHE染色显示OST组细胞ROS水平较对照组显著提高。6、进一步分组后,DHE染色结果提示NAC预处理对OST引起的ROS水平升高有明显的抑制作用;Hoechst 33342染色显示NAC预处理组细胞凋亡情况较OST组有明显改善;流式检测结果表明NAC预处理组细胞凋亡率较OST组细胞显著下降(P<0.05);Western blot结果显示NAC预处理均减弱了OST对Cal-27细胞凋亡及抗凋亡蛋白Bax、Bcl-2和NF-κB通路中p65、IκB-α、IKKβ的影响,同时增加了Cal-27细胞的抗氧化蛋白HO-1、Nrf2的表达。结论OST能够抑制舌鳞癌Cal-27细胞的增殖,促使其凋亡,其机制可能与ROS/NF-κB信号通路有关。

关键词：蛇床子素舌鳞癌 Cal-27细胞凋亡活性氧 NF-κB信号通路

蛇床子素对增生性瘢痕的抑制作用及其机制研究

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蛇床子素对增生性瘢痕的抑制作用及其机制研究

作者：崔芷薇中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景增生性瘢痕是一种常见的继发于皮肤损伤的疾病,常发生于创伤、烧伤或外科手术后。增生性瘢痕常常会导致外形不美观、伤口处疼痛和瘙痒等,若是在关节处的瘢痕可能还会造成功能限制,给患者的生理和心理都造成了巨大的负担。增生... 详细信息

研究背景增生性瘢痕是一种常见的继发于皮肤损伤的疾病,常发生于创伤、烧伤或外科手术后。增生性瘢痕常常会导致外形不美观、伤口处疼痛和瘙痒等,若是在关节处的瘢痕可能还会造成功能限制,给患者的生理和心理都造成了巨大的负担。增生性瘢痕是创面的过度愈合导致的纤维化疾病,在此过程中,成纤维细胞起到了关键的作用,通过分泌胶原蛋白等细胞外基质,及发挥收缩作用促进伤口愈合。因此,研究增生性瘢痕的发病机制对具有重要的临床和理论意义。目前,增生性瘢痕已有多种治疗方法,如手术切除、类固醇类激素、5-氟尿嘧啶等,目前的药物治疗均具有一定的局限性,激素类药物易造成色素沉着或易复发等副作用。找寻一种新的药物用于增生性瘢痕防治具有重要的理论和临床意义。蛇床子素(Osthole),是一种最早从蛇床子属植物中获得的香豆素衍生物,因为其具有广泛的药理作用,近年来受到学者的关注。蛇床子素可以抑制多种癌症的发生,如肺癌、宫颈癌等。同时蛇床子素也在抑制多种器官纤维化中发挥了重要作用。目前尚没有其对增生性瘢痕或增生性瘢痕成纤维细胞的明确研究。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种酪氨酸激酶受体,其磷酸化可以激活下游许多种通路,其中包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)。此信号通路在多种器官如心肌和肺的纤维化中也起到了重要的作用。通过以上背景知识,我们推测蛇床子素可以通过EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路对增生性瘢痕这种纤维化疾病起到治疗作用,本实验对此进行验证。研究目的探究蛇床子素是否是通过EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路对增生性瘢痕起到抑制作用。研究方法在第一部分中,我们主要是从体外实验检测了蛇床子素对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖、凋亡、迁移以及收缩等细胞功能的影响,然后收集处理后的细胞进行实时定量聚合酶链反应(quantitative Polymerase chain reaction,qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot),进一步分析可能的分子机制。首先使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖实验和EdU细胞增殖实验检测瘢痕成纤维细胞的增殖能力;使用Annexin V/PI染色检测蛇床子素对细胞的凋亡效果;利用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验、qPCR和Western blot检测基质金属蛋白酶(Metallomatrix proteinases,MMPs)的表达,以验证蛇床子素对瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响;使用凝胶收缩实验和细胞免疫荧光检测瘢痕成纤维细胞的活化与收缩能力;通过qPCR和Western blot检测细胞外基质的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平以确定增生性瘢痕的形成情况。通过查阅文献以及借助网络药理学进行相关的通路预测,最后使用Western blot验证EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关蛋白的磷酸化水平变化。在第二部分中,我们构建了兔耳增生性瘢痕模型,检测蛇床子素对增生性瘢痕的治疗作用。首先构建兔耳增生性瘢痕模型,待兔耳创面完全上皮化后,开始瘢痕内给药,共分为三组,对照组、100 m M蛇床子素组和200 m M蛇床子素组。每3天注射一次,共注射八次。给药结束后三天进行取材,兔耳组织分为三部分,一部分固定包埋进行石蜡切片,一部分保存于RNA later用于后续的qPCR实验,另一部分液氮冻存用于后续的Western blot检测。首先对组织切片进行HE染色,并使用Image J分析计算瘢痕增生指数,马松染色用以观察各组兔耳瘢痕组织的胶原沉积情况,并计算胶原容积分数;其次利用qPCR和Western blot检测瘢痕组织中胶原沉积以及成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化情况。研究结果在体外实验中,我们发现蛇床子素可以剂量依赖性地抑制人瘢痕成纤维细胞的增殖,并促进其凋亡;蛇床子素可以通过减少瘢痕成纤维细胞MMPs的分泌等途径,抑制其迁移能力;蛇床子素可以通过抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的途径,来抑制其收缩能力;蛇床子素可以抑制瘢痕成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达进而减轻细胞外基质沉积。网络药理学分析确定了蛇床子素与增生性瘢痕的共同作用靶点,Western blot验证了蛇床子素可以降低EGFR、PI3K、AKT和mTOR蛋白分子的磷酸化水平,从而证实其功能主要是通过调节EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路分子的磷酸化进行的。在体内实验中,我们发现蛇床子素可以显著抑制兔耳增生性瘢痕瘢痕形成,HE染色证实了蛇床子素可以显著降低瘢痕指数,马松染色结果显示蛇床子素可以使

关键词：蛇床子素增生性瘢痕兔耳增生性瘢痕模型表皮生长因子受体