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虾肝肠胞虫水通道蛋白基因EHP00_492的克隆与表达特征分析

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广东农业科学 2023年第8期50卷 154-162页

作者：李晨曦吴慧欣吴玉娇陈洁孟宪志潘国庆龙梦娴西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室/微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室重庆400715 西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院重庆400715

【目的】克隆虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)水通道蛋白编码基因EHP00_492,分析其在EHP成熟孢子中的表达特征,为研究EHP水通道蛋白的功能提供理论基础。【方法】以虾肝肠胞虫为材料,克隆获得完整的EHP00_492基因,对其进... 详细信息

【目的】克隆虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)水通道蛋白编码基因EHP00_492,分析其在EHP成熟孢子中的表达特征,为研究EHP水通道蛋白的功能提供理论基础。【方法】以虾肝肠胞虫为材料,克隆获得完整的EHP00_492基因,对其进行序列特征分析,构建pCold-TF-EHP00_492重组表达载体,转化至大肠杆菌中异源表达重组蛋白,制备兔多克隆抗体。利用蛋白免疫印迹实验和间接免疫荧光实验分析EHP00_492在EHP成熟孢子中的表达定位特征。【结果】EHP00_492的编码基因全长729 bp,由242个氨基酸组成,富含亮氨酸,预测分子量为25 kD,无信号肽,含有6个跨膜结构域,具有MIP蛋白家族结构域和2个水通道蛋白保守的NPA/G基序。此外,EHP00_492与其他微孢子虫水通道蛋白序列同源性较高,系统进化树分析结果显示,EHP00_492与毕氏肠胞虫EBI_27080蛋白亲缘关系最近。AlphaFold分析发现,EHP00_492与已鉴定的家蚕微孢子虫水通道蛋白NbAQP和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白EcAQP的蛋白质三维结构高度相似,推测EHP00_492是一个潜在的水通道蛋白。蛋白免疫印迹结果显示,EHP00_492蛋白在EHP成熟孢子中有表达,分子量为21 kD。亚细胞定位分析结果显示,EHP00_492蛋白定位于EHP成熟孢子的孢壁上。【结论】初步明确了EHP00_492蛋白的序列特征、结构特征及其与其他微孢子虫水通道蛋白的亲缘关系,以及其在EHP成熟孢子中的表达定位特征,可为进一步研究EHP水通道蛋白的功能提供基础。

关键词：虾肝肠胞虫水通道蛋白基因克隆序列特征表达亚细胞定位

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虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究进展

水产科学 2022年第3期41卷 504-508页

作者：曹海鹏夏婷婷许拉盖春蕾上海海洋大学国家水生动物病原库上海水产养殖工程技术研究中心上海201306 山东省海洋生物研究院山东省海水养殖病害防治重点实验室山东青岛266104

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei),又名“肠道上皮细胞孢子虫”,于2003年被Chayaburakul等[1]首次发现,2009年由Tourtip等[2]从生长缓慢的斑节对虾(Penaeusmonodon)中分离并命名,主要感染斑节对虾、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等主要养殖虾类,除了长期肆虐印度、韩国、泰国等[3-5]多个国家的对虾养殖外,对我国对虾养殖业和食品安全也造成了威胁。2013年,我国养殖凡纳滨对虾首次检出虾肝肠胞虫,随后在江苏、山东、辽宁等地[6-9]的养殖对虾中也出现了不同程度的虾肝肠胞虫感染。

关键词：虾肝肠胞虫生物学特性检测控制

虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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水产学杂志 2023年第2期36卷 8-13页

作者：张先东付静静刘伟琪罗颖邓桦杨鸿侯月娥佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528000 珠海科艺普检测科技有限公司广东珠海519000

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反... 详细信息

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R~2=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明:检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示:批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。

关键词：南美白对虾虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR 方法建立应用

虾肝肠胞虫Septin的生物信息学分析及其在增殖中的潜在作用

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南京师大学报(自然科学版) 2023年

作者：张晟乔毅曹晓慧张雷霆成婕吴海龙沈辉江苏海洋大学江苏省海洋水产研究所南京师范大学

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是对虾养殖业的重要病原体之一，但其裂殖增殖的分子机制尚不明确。本研究通过克隆和分析EHP裂殖期Septin蛋白EhpSeptin的基因序列、表达及定位，初步阐释了该基因在EHP裂殖中的潜在作用... 详细信息

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是对虾养殖业的重要病原体之一，但其裂殖增殖的分子机制尚不明确。本研究通过克隆和分析EHP裂殖期Septin蛋白EhpSeptin的基因序列、表达及定位，初步阐释了该基因在EHP裂殖中的潜在作用。结果表明，EhpSeptin基因序列编码265个氨基酸的蛋白质，分子量约30.4 kDa，等电点4.75。构建EhpSeptin原核表达载体，获得高纯度表达蛋白。Western blotting验证了表达蛋白与天然蛋白一致。此外，本研究建立了EhpSeptin基因显色原位杂交技术（Chromogenic in Situ Hybridization，CISH），分析感染对虾样本中EhpSeptin的表达模式。结果显示，EhpSeptin的表达水平随EHP感染强度增加而升高，表明其参与了EHP的裂殖过程。本研究首次报道了EHP裂殖相关蛋白EhpSeptin的克隆、表达、定位及其在EHP感染过程中的变化规律，为探究EHP裂殖分子机制和防治该病原体的感染提供了理论基础和技术手段。

关键词：虾肝肠胞虫 Septin 原核表达显色原位杂交

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虾肝肠胞虫感染对脊尾白虾肠道菌群的影响

渔业科学进展 2022年第3期43卷 75-83页

作者：段健诚胡吉卉沈宇航邓高威高威牟华张庆起高焕江苏海洋大学海洋科学与水产学院江苏省海洋生物技术重点实验室江苏连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005 江苏省农业种质资源保护与利用平台江苏南京210014 连云港赣榆佳信水产开发有限公司江苏连云港222100

为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响,本研究基于16S rRNA基因的测序结果,对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示,感染虾与健康虾肠道菌群差异较大,... 详细信息

为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响,本研究基于16S rRNA基因的测序结果,对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示,感染虾与健康虾肠道菌群差异较大,且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现,病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified Alphaproteobacteria)为优势菌,而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P虾肠道菌群主要用于新陈代谢,从而抵抗EHP侵染,维持机体正常功能;健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理,进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手,进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响,以期为EHP的防治提供帮助。

关键词：虾肝肠胞虫脊尾白虾肠道菌群多样性功能预测

虾肝肠胞虫PCR检测方法的建立及对凡纳滨对虾的感染研究

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虾肝肠胞虫PCR检测方法的建立及对凡纳滨对虾的感染研究

作者：侯子豪鲁东大学

学位级别：硕士

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是一种专性细胞内寄生虫,主要寄生在对虾肝胰腺组织的肝小管上皮细胞中,成熟孢子多为椭圆形,大小约为0.9μm×1.8μm,属于微孢子虫科（Microsporidia）、肠胞虫属（Enterocytozoon）。EHP... 详细信息

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是一种专性细胞内寄生虫,主要寄生在对虾肝胰腺组织的肝小管上皮细胞中,成熟孢子多为椭圆形,大小约为0.9μm×1.8μm,属于微孢子虫科（Microsporidia）、肠胞虫属（Enterocytozoon）。EHP于2003年在泰国生长缓慢的斑节对虾（Penaeus monodon）中首次报道,2009年被成功分离并确定为孢子虫属的一个新物种。EHP宿主广泛,凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（P.monodon）和脊尾白虾（Palaemon carincauda）等虾类都是其主要感染对象,EHP感染致虾类患肝胰腺微孢子虫病（Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM）。虾类感染EHP后没有明显的病理特征,主要表现为生长速度缓慢甚至停止生长,个体大小差异明显。其不会导致虾类死亡,但感染严重时,经常伴随着各类对虾疾病。EHP给对虾养殖产业造成了很大的经济损失,目前已成为影响全球虾类养殖生产的重要病原之一。从2013年起,我国辽宁、天津、江苏、浙江和广东等多个省市的虾类养殖基地先后发现EHP的感染,部分地区的EHP阳性率甚至高达70%、80%以上,且呈逐年增长的趋势,EHP及其引发的感染病已经严重危害了我国虾类养殖产业。为详细研究EHP对凡纳滨对虾的感染,更加准确、快捷地检测EHP,本文建立了一种更灵敏、特异的EHP PCR检测方法,并且研究了EHP对凡纳滨对虾不同组织器官的感染情况,主要实验结果如下:1.建立了一种全新的EHP常规PCR检测方法,预期片段为358 bp,相比于之前的常规PCR方法（EHP 510和EHP 413）,EHP 358具有更高的灵敏度和更好的特异性,最低可检测到20 copies的EHP DNA,且不与其他常见对虾病原发生交叉反应,适合应用于大量样品的检测。2.为调查EHP在山东地区的流行情况,从山东省不同地区采集了不同时期、不同大小和不同发育阶段的凡纳滨对虾样品,利用本研究建立的EHP常规PCR检测方法进行检测,结果表明山东省四个地区639只凡纳滨对虾样品EHP的阳性率为51.2%,部分地区例如烟台芝罘区、滨州市北海新区等的样品阳性率甚至高达70%以上,说明EHP在山东地区的传播、感染较为严重。3.通过人工投喂的方式研究了EHP对凡纳滨对虾不同器官的感染情况。证明了在较短时间（10天）内,EHP就能感染凡纳滨对虾,然后扩增至对虾体内的其他不同组织器官,且不同组织器官感染有所差异,其中中肠感染最为严重,EHP平均载量最高。该实验结果表明,凡纳滨对虾很容易通过摄食途径被EHP感染,EHP存在较大的水平传播风险,在对虾养殖生产中应加强防范。

关键词：虾肝肠胞虫凡纳滨对虾常规PCR 攻毒实验流行病学

虾肝肠胞虫假定水通道蛋白EHP00＿492的鉴定及其在孢子发芽中的作用

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虾肝肠胞虫假定水通道蛋白EHP00＿492的鉴定及其在孢子发芽中的作...

作者：李晨曦西南大学

学位级别：硕士

微孢子虫是一种典型的专性细胞内寄生的真核微生物。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)作为感染对虾肝胰腺的微孢子虫,能引发对虾肝胰腺微孢子虫病(HPM)。该病原感染早期宿主不会出现明显病症,在感染30-45天后对虾才会出现... 详细信息

微孢子虫是一种典型的专性细胞内寄生的真核微生物。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)作为感染对虾肝胰腺的微孢子虫,能引发对虾肝胰腺微孢子虫病(HPM)。该病原感染早期宿主不会出现明显病症,在感染30-45天后对虾才会出现显著生长缓慢。由于暂无有效防治措施,EHP的传播已给全球对虾养殖业带来巨大的经济损失。微孢子虫侵染机制相当特殊,即适宜环境刺激下,微孢子虫发芽,孢内极丝迅速释放到孢外并形成中空的极管,侵染性孢原质通过此管道运输至宿主细胞内,完成侵染。研究发现:水通道蛋白参与了微孢子虫发芽的激活过程。因此,对EHP水通道蛋白的鉴定与功能研究将有利于更好地解析EHP发芽机制,为EHP防控提供新思路与参考。本研究对EHP假定水通道蛋白EHP00＿492的序列特征、表达定位特征进行分析,发现EHP00＿492具有水通道蛋白家族成员的保守特征,是EHP潜在的水通道蛋白。为进一步探究EHP00＿492的功能,本研究分析了高浓度蔗糖对EHP发芽能力的影响以及EHP00＿492抗体封闭前后,高浓度溶液对EHP孢内膜结构影响的变化,证实了EHP00＿492在EHP孢子中具有调节孢内外渗透压的功能。主要研究结果如下:1.生物信息学分析根据不同微孢子虫基因座位保守性,筛选获得EHP假定水通道蛋白EHP00＿492。EHP00＿492编码基因全长共729 bp,编码242个氨基酸,具有一个保守的水通道蛋白超家族结构域(pfam:MIP)。TMHMM软件分析发现其具有6个跨膜结构域,分别在第12-31、41-60、91-113、113-155、176-198、218-240位氨基酸位置,该蛋白序列中还含有两个水通道蛋白的保守结构基序NPA(AsnPro-Ala),分别位于69-71位和201-203位氨基酸处,且呈对称分布。根据同源序列比对结果发现,EHP00＿492与其他微孢子虫同源同源蛋白相似性极高,尤其与毕氏肠微孢子虫(Ent.bieneusi)的假定水通道蛋白(Gen Bank No.EBI＿27080)同源性最高,可达73%,与兔脑炎微孢子虫(ECU07＿0740)的序列相似性为47%,与海伦脑炎微孢子虫(EHEL＿060160)的序列相似性为48%,与肠脑炎微孢子虫(Eint＿070680)的序列相似性为46%。通过MEGA软件进行系统进化树分析,发现与EHP00＿492进化关系最近的是毕氏肠微孢子虫的水通道蛋白。此外,相较于人与对虾的水通道蛋白,微孢子虫水通道蛋白与酵母水通道蛋白的亲缘关系更近。通过Alpha Fold构建EHP00＿492、兔脑炎微孢子虫Ec AQP和家蚕微粒子虫Nb AQP的蛋白三维结构模型比对结果表明这三个蛋白的三维结构在10-32位、42-126位、129-160位、172-242位氨基酸处存在高度重叠,暗示其蛋白功能在微孢子虫中的保守性。2.虾肝肠胞虫EHP00＿492表达定位特征分析通过差速离心结合蔗糖密度梯度离心,从感染EHP的对虾肝胰腺组织中分离纯化EHP孢子,并提取其总RNA,反转为c DNA后作为模板,进行RT-PCR扩增,得到750 bp左右的单一条带,测序结果比对发现EHP00＿492基因中无内含子,该基因在EHP孢子中能正常转录。将该编码基因连接至原核表达载体p ColdTF中构建重组质粒,利用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-1-thio-β-Dgalactoside,IPTG)诱导重组质粒p Cold-TF-EHP00＿492在大肠杆菌表达菌株中进行异源表达,纯化r EHP00＿492蛋白,并将重组蛋白r EHP00＿492免疫新西兰大白兔制备兔多克隆抗体。蛋白免疫印迹实验检测EHP00＿492在EHP孢子中的表达特征,结果表明;其能特异性识别EHP孢子总蛋白中约21 k Da的天然蛋白。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence analysis,IFA)与免疫电镜观察(Immunoelectron microscopy,IEM)分析EHP00492的亚细胞定位特征,发现它能特异性定位至EHP成熟孢子的孢壁与原生质膜。因此,根据EHP00＿492的序列、蛋白表达定位特征分析,本研究证实EHP00＿492具有水通道蛋白家族的保守特征,是EHP潜在的水通道蛋白。3.虾肝肠胞虫EHP00＿492功能初探前期研究学者证实高浓度蔗糖溶液可抑制微孢子虫N.algerae发芽。为了研究蔗糖对EHP发芽的影响,本文使用2 M蔗糖处理EHP孢子后,0.1 M KOH体外诱导孢子发芽,结果发现:0.1 M KOH处理可激活EHP孢子发芽,但2 M蔗糖处理后EHP孢子发芽能力明显受到抑制。蔗糖透析后的EHP发芽能力能被恢复,进一步表明高浓度蔗糖可抑制EHP发芽。文献报道,微孢子虫发芽与孢内极膜层、后极泡结构膨胀密切相关。本研究利用D

关键词：虾肝肠胞虫水通道蛋白序列特征表达特征发芽功能

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)的研究进展

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水产学杂志 2022年第3期35卷 98-107页

作者：李浩澜沈辉顾伟孟庆国万夕和乔毅范贤平蒋葛李吉云江苏省海洋水产研究所江苏南通226007 南京师范大学海洋科学与工程学院江苏南京210046

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种专性细胞内寄生虫,主要侵染斑节对虾(Penaeus monodon)及南美白对虾(Litopenaeus vannamei)。EHP感染后对虾生长迟缓,经济损失严重,是近年来危害对虾行业发展的新型重要病原,引起了... 详细信息

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种专性细胞内寄生虫,主要侵染斑节对虾(Penaeus monodon)及南美白对虾(Litopenaeus vannamei)。EHP感染后对虾生长迟缓,经济损失严重,是近年来危害对虾行业发展的新型重要病原,引起了广泛关注。本文着重介绍了EHP病原学、流行病学、病理学、检测手段以及防治措施等,为进一步研究与防控虾肝肠胞虫病提供参考。

关键词：虾肝肠胞虫 EHP 病原学流行病学病理学检测防控

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虾肝肠胞虫的3种快速显微镜检查法

西南大学学报（自然科学版） 2021年第3期43卷 17-23页

作者：陈洁廖国礼吴玉娇张庆杨小娟范晓东龙梦娴潘国庆周泽扬西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室/微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室重庆400715 中国水产科学院珠江水产研究所广州510380 重庆师范大学生命科学学院重庆401331

虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei是近年来备受关注的病原性微孢子虫,严重影响对虾生长,并在东南亚及我国大部分对虾主产区迅速蔓延,极大地制约对虾养殖业的健康发展.特异、快速、便利地确诊EHP感染,在对虾育种、育苗及养殖过程... 详细信息

虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei是近年来备受关注的病原性微孢子虫,严重影响对虾生长,并在东南亚及我国大部分对虾主产区迅速蔓延,极大地制约对虾养殖业的健康发展.特异、快速、便利地确诊EHP感染,在对虾育种、育苗及养殖过程中具有重要意义.本研究基于微孢子虫的孢子具有高度折光性,孢壁结构含较厚几丁质层及碘化丙啶可穿透孢子活细胞膜的特性,开展虾肝肠胞虫的光学显微成像研究,展示普通光镜法、微分干涉差显微成像法、荧光增白剂(fluorescent brightener 28)染色法及与碘化丙啶(Propidium Iodide)共染的双色荧光法在虾肝肠胞虫快速光镜检测诊断中的应用.实验建立的双色荧光镜检法无需固定和洗涤,具有操作简便,无专业技术要求的特点,可在10 min内完成样品的初筛检测,为虾肝肠胞虫的早期筛查及养殖塘样品快速诊断提供价廉、省时且易操作的检测手段.

关键词：虾肝肠胞虫显微镜检查法微分干涉差荧光增白剂碘化丙啶