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日本血吸虫核糖核酸酶AY841845蛋白的表达与功能分析

日本血吸虫核糖核酸酶AY841845蛋白的表达与功能分析

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作者：刘茜江苏省血吸虫病防治研究所

学位级别：硕士

血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患病,全世界有6-7亿人生活在血吸虫病流行区,血吸虫感染者人数超过了2亿,我国流行的是日本血吸虫病。血吸虫感染对人体最严重的危害是在患者肝脏中产生虫卵肉芽肿炎症,随后形成肝纤维... 详细信息

血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患病,全世界有6-7亿人生活在血吸虫病流行区,血吸虫感染者人数超过了2亿,我国流行的是日本血吸虫病。血吸虫感染对人体最严重的危害是在患者肝脏中产生虫卵肉芽肿炎症,随后形成肝纤维化、肝硬化,患者的肝功能受到严重损害。随着感染的发展,宿主免疫反应平衡逐渐由Th1向Th2反应方向漂移,最后形成以Th2反应为主的极化状态。形成这一病理变化过程的分子机制依然未完全阐明,显然,虫源性的抗原分子对宿主免疫系统功能的调节在这一过程中发挥了至关重要的作用。国外众多的研究结果表明,寄生虫的核糖核酸酶分子(如肝吸虫、曼氏血吸虫,等等)具有强力的Th2型免疫反应极化作用,曼氏血吸虫虫卵中的Omega-1蛋白分子已被证明是曼氏血吸虫虫卵中最主要的Th2型免疫反应诱导成分,去除曼氏血吸虫虫卵中的Omega-1分子会显著下调虫卵抗原分子的Th2极化作用。本课题组前期的研究工作证明虫卵特有的外分泌蛋白Sj CP1412是日本血吸虫虫卵抗原中主要的Th2免疫反应极化分子,其免疫调节作用与其核糖核酸酶活性相关。我们的生物信息学分析结果显示,在已发表的日本血吸虫基因序列中存在多个核糖核酸酶T2家族成员,它们都具有核糖核酸酶T2家族的保守功能基团序列。为进一步研究核糖核酸酶T2家族成员在日本血吸虫感染免疫调节中的作用,本研究对Genbank中登录号为AY841845的蛋白分子进行了基因克隆、蛋白表达、纯化与功能分析。研究内容主要包括以下几个方面。一、Sj AY841845蛋白基因克隆、蛋白表达与纯化根据已发表的Sj AY841845基因序列,合成基因特异性引物,采用PCR技术从日本血吸虫成虫c DNA文库中扩增出编码Sj AY841845蛋白成熟肽的基因片段,其长度为636bp。再通过限制性内切酶Bam H1和Sal1位点将编码Sj AY841845的基因片段亚克隆到表达质粒p ET41a(+)中,构建重组表达质粒p ET41a-Sj AY841845。经过限制性酶切分析和DNA测序证实目的基因片段已正确插入,并与载体上的谷胱甘肽转移酶基因(Glutathione S-transferase,GST)进行了框内融合。随后,将重组表达质粒p ET41a-Sj AY841845转化到大肠杆菌BL21(DE3)中形成表达工程菌p ET41a-Sj AY841845/***21(DE3),在LB培养基中用IPTG对表达工程菌p ET41a-Sj AY841845/***21(DE3)进行诱导,获得重组表达的GST-Sj AY841845融合蛋白,分子量为57.2k Da。将表达产物用8M尿素溶解,采用镍柱亲和层析法对表达产物中的重组GST-SjAY841845融合蛋白进行纯化,获得了纯化的重组GST-Sj AY841845融合蛋白。然后,将变性条件下纯化的重组GST-Sj AY841845蛋白用梯度尿素PBS进行透析,并加入0.5 M精氨酸,使变性状态的GST-Sj AY841845融合蛋白复性成可溶性蛋白。用肠激酶(Enterokinase,EK)将复性后得到的可溶性GST-Sj AY841845融合蛋白进行酶切,切除GST标签。酶切产物再过镍亲和层析柱,收集穿透液,获得去除GST标签的纯化重组Sj AY841845蛋白,电泳结果显示其大小与预测的Sj AY841845蛋白成熟肽大小(24.9k Da)相似。二、Sj AY841845核糖核酸酶活性及其表达谱分析用纯化的Sj AY841845蛋白对酵母t RNA进行消化,结果显示随着重组Sj AY841845蛋白量的增加,其水解酵母t RNA的能力也提高,表明纯化的重组Sj AY841845蛋白具有核糖核酸酶活性。分别制备日本血吸虫不同发育阶段虫体(虫卵、尾蚴、成虫)的m RNA和可溶性蛋白,以等量的m RNA为模板和等量的蛋白抗原,分别进行RT-PCR扩增和免疫印渍分析,以检测Sj AY841845在日本血吸虫不同发育阶段的表达水平。PCR产物的电泳结果显示在日本血吸虫的成虫,尾蚴及虫卵阶段都可以扩增出大小与Sj AY841845预期大小(636bp)基因片段相同的特异性DNA片段。免疫印渍结果也显示Sj AY841845在日本血吸虫的不同发育阶段均有表达。三、Sj AY841845蛋白的免疫调节功能分析:以纯化的重组Sj AY841845刺激巨噬细胞RAW264.7,采用ELISA检测受刺激巨噬细胞培养上清液中IL-12、IL-10的表达水平,用RT-PCR检测巨噬细胞中i NOS、Arg-1 m RNA的表达水平,流式分析检测巨噬细胞表面CD206、CD16/32的表达水平。检测结果显示重组Sj AY841845能刺激巨噬细胞分泌高水平的IL-10,

关键词：日本血吸虫核糖核酸酶T2 AY841845蛋白免疫调节虫卵肉芽肿病变

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