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藤仓赤霉的诱变及营养缺陷型筛选研究

华中师范大学学报（自然科学版） 1993年第4期27卷 507-511页

作者：向阳华中师范大学生物系

分别用亚硝基胍和紫外线处理赤霉素生产菌藤仓赤霉的小型分生孢子,筛选出25株不同营养要求的营养缺陷型。比较了两种诱变剂的不同诱变剂量对休眠孢子及不同萌发程度的孢子的诱变率及存活率的影响。结果表明,在亚硝基胍诱变剂量为1.92M×... 详细信息

分别用亚硝基胍和紫外线处理赤霉素生产菌藤仓赤霉的小型分生孢子,筛选出25株不同营养要求的营养缺陷型。比较了两种诱变剂的不同诱变剂量对休眠孢子及不同萌发程度的孢子的诱变率及存活率的影响。结果表明,在亚硝基胍诱变剂量为1.92M×S时,诱变萌发7小时的孢子,诱变率可高达1.35%。

关键词：藤仓赤霉营养缺陷型诱变真菌

藤仓赤霉基因敲除体系的建立和p450-3基因敲除对赤霉素合成的影响

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藤仓赤霉基因敲除体系的建立和p450-3基因敲除对赤霉素合成的影响

作者：李超浙江工业大学

学位级别：硕士

赤霉素(Gibberellins,GAs)是一种高效的植物生长调节剂,具有促进茎的伸长、打破休眠、诱花促果等作用。水稻恶苗病原菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)可生产多种高活性的赤霉素,但是目前工业化生产的发酵水平不高。通过对藤仓赤霉赤霉... 详细信息

赤霉素(Gibberellins,GAs)是一种高效的植物生长调节剂,具有促进茎的伸长、打破休眠、诱花促果等作用。水稻恶苗病原菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)可生产多种高活性的赤霉素,但是目前工业化生产的发酵水平不高。通过对藤仓赤霉赤霉素生物合成途径中的基因进行研究,有助于赤霉素高产工程菌株的构建。利用同源重组对目的基因进行基因敲除,是研究丝状真菌基因功能的主要手段。本研究建立了一种基于重叠延伸PCR技术构建大片段、以藤仓赤霉原生质体为受体的基因同源重组敲除体系,并将该体系应用于藤仓赤霉p450-3基因的敲除。用几种真菌细胞壁降解酶进行了赤霉菌原生质体的制备,初步探索出了高效的藤仓赤霉原生质体制备方法:细胞壁降解酶Driselase和Yaterlase比例3:7,酶浓度15mg/mL,37℃酶解3h可达到最佳效果。1g新鲜藤仓赤霉菌丝可得到浓度约为5.13×10个/mL的原生质体。对重叠延伸PCR技术进行了优化,成功将藤仓赤霉p450-3基因800 bp上下游同源序列和中间1860 bp潮霉素抗性序列连接成3460bp的大片段。PCR程序为:94℃预热2min;94℃变性30s,58℃退火10min,72℃延伸5min,35个循环;72℃最终延伸10min。利用CaCl-PEG介导的方法将p450-3敲除大片段成功转化藤仓赤霉原生质体,最终两批次转化共得108个转化子,转化率约为56个/μg DNA。对转化子进行抗性稳定性检测,得到93个有稳定潮霉素抗性的转化子。以PCR方法鉴定出的27个转化子中,随机挑取7个转化子(T3、T5、T9、T10、T23、T27、T34)进一步以Southern blot、RT-PCR鉴定,结果表明其中5个为p450-3敲除株(T5、T10、T23、T27、T34),2个为假阳性(T3、T9)。对藤仓赤霉野生型和基因敲除株在菌株表型和赤霉素生产能力方面进行了研究。结果发现:基因敲除株较野生型菌株在PDA平板上生长速率差异不显著,但在菌丝形态上有可见的区别。敲除株在显微镜下多为菌丝碎段且粗细极不均匀。表明p450-3基因的缺失会在一定程度上影响菌丝的生长发育,导致藤仓赤霉菌丝更加脆弱易碎。在赤霉素生产能力方面,野生型产量为GA 400mg/L、GA 102mg/L、GA 488mg/L;p450-3基因敲除株不产生GA,同时也不产生GA和GA。可推测p450-3极有可能作为多功能基因牵涉赤霉素生物合成途径中更为复杂的催化步骤,而不只是催化GA至GA的步骤。对经过PCR鉴定的20株转化子和经过Southern杂交鉴定的5株p450-3基因敲除转化子进行了赤霉素发酵检测,结果表明:11株转化子不产生GA、GA、GA;14个转化子赤霉素效价与野生型无显著性差异。本研究为藤仓赤霉基因敲除体系的建立、赤霉素高产工程菌株的构建、赤霉素生物合成途径中基因功能的深入解析提供了参考依据。

关键词：藤仓赤霉赤霉素基因敲除转化体系

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赤霉素产生菌藤仓赤霉原生质体的形成和再生

真菌学报 1992年第3期11卷 221-228页

作者：李武军郑幼霞王洪洲陆小燕中国科学院上海植物生理研究所上海200032

生长在含2%甘氨酸的G培养基上的藤仓赤霉菌菌丝体,经二硫苏糖醇作预处理,其细胞壁对纤维素酶和溶菌酶的混合酶液敏感,它们的适宜浓度是纤维素酶1.5%,溶菌酶0.7%。在高渗液中酶解3—4小时,细胞壁被逐渐溶解并大量释放原生质体(约10~7/ml)... 详细信息

生长在含2%甘氨酸的G培养基上的藤仓赤霉菌菌丝体,经二硫苏糖醇作预处理,其细胞壁对纤维素酶和溶菌酶的混合酶液敏感,它们的适宜浓度是纤维素酶1.5%,溶菌酶0.7%。在高渗液中酶解3—4小时,细胞壁被逐渐溶解并大量释放原生质体(约10~7/ml),再生率在50%以上。观察了在PDS液体培养基中原生质体再生成菌丝体的方式,看到菌丝再生或者是单球直接生长或者是经过一次、两次或多次的细胞分裂。对原生质体进行X射线照射诱变和进行终代谢产物高抗性变种筛选,挑高产赤霉素菌株,获得了良好的结果。

关键词：赤霉素藤仓赤霉原生质体再生

藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)分子生物学及发酵工程研究进展

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工业微生物 2016年第2期46卷 47-55页

作者：李超杨佳羽刘佳朱廷恒浙江工业大学生物工程学院杭州310004

赤霉素是最重要的植物生长调节剂之一,工业化生产是由丝状真菌藤仓赤霉发酵产生。近20年来,随着分子生物学技术的发展,对藤仓赤霉赤霉素生物合成途径中相关基因的分子鉴定和表达调控等研究取得了显著的进展,赤霉素生物合成途径的分子生... 详细信息

赤霉素是最重要的植物生长调节剂之一,工业化生产是由丝状真菌藤仓赤霉发酵产生。近20年来,随着分子生物学技术的发展,对藤仓赤霉赤霉素生物合成途径中相关基因的分子鉴定和表达调控等研究取得了显著的进展,赤霉素生物合成途径的分子生物学基本研究清楚,使得利用基因工程和代谢工程技术进行赤霉菌改良、提高赤霉素发酵水平成为可能。本文对藤仓赤霉中赤霉素合成机理及其表达调控、关键酶基因功能、外源基因转化系统、发酵技术、利用基因工程技术进行改造等方面的研究进展进行综述。

关键词：藤仓赤霉分子机理生物合成基因表达调控发酵

藤仓赤霉菌丝体、原生质体及其融合的电镜观察

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微生物学报 1994年第4期34卷 316-318页

作者：李武军郑幼霞中国科学院上海植物生理研究所上海200032

描述了藤仓赤霉菌丝体、原生质体及其融合的超微结构,包括细胞壁、菌丝隔膜、核、内质网、脂质粒、排泄泡等.原生质体中97%为单核,大约2.5%为双核体.

关键词：藤仓赤霉原生质体融合

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赤霉素产生菌——藤仓赤霉菌融合重组的研究

微生物学报 1995年第4期35卷 271-274页

作者：李武军郑幼霞中国科学院上海植物生理研究所上海200032

以一对营养互补的缺陷型突变株作为亲本,酶法去除细胞壁制成原生质体,以等量相混,用30%PEG 4000诱导融合,在最低营养再生培养基上直接选择原养型融合重组子,重组频率约为10^-,同时产生一定数量的不稳定异核体,频率约为10^(-5)—10^(-6)... 详细信息

以一对营养互补的缺陷型突变株作为亲本,酶法去除细胞壁制成原生质体,以等量相混,用30%PEG 4000诱导融合,在最低营养再生培养基上直接选择原养型融合重组子,重组频率约为10^-,同时产生一定数量的不稳定异核体,频率约为10^(-5)—10^(-6).融合重组导致色素产生和菌丝形态及赤霉素产生能力的多种变异.融合重组子中赤霉素产量的正变率为15.3%.其中RN2和RG14菌株的赤霉素产量比原养型出发菌株207提高25%以上.

关键词：藤仓赤霉原生质体融合重组赤霉素产生菌真菌

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藤仓赤霉菌色素形成能力的遗传研究

广东农业科学 2009年第7期36卷 202-204页

作者：周晓云陈法徐陈贤王克荣广州市花卉研究中心广东广州510360 南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

通过菌株的无性继代培养和有性杂交方法,对藤仓赤霉菌(串珠镰孢霉)形成色素的能力及其遗传稳定性进行研究。试验结果表明,串珠镰孢霉产生色素的能力在无性后代中稳定遗传;从色素形成量不同的菌株间杂交试验结果,首次提出由单主效基因控... 详细信息

通过菌株的无性继代培养和有性杂交方法,对藤仓赤霉菌(串珠镰孢霉)形成色素的能力及其遗传稳定性进行研究。试验结果表明,串珠镰孢霉产生色素的能力在无性后代中稳定遗传;从色素形成量不同的菌株间杂交试验结果,首次提出由单主效基因控制色素前体产生,而表型色素产生量的多少受一定数量微效基因控制,且这些微效基因与色素产生量以及色素形成的快慢有关。

关键词：藤仓赤霉串珠镰孢霉继代培养有性杂交色素

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微生物发酵产赤霉素的研究进展

化工进展 2016年第11期35卷 3611-3618页

作者：彭辉施天穹聂志奎郭东升黄和纪晓俊南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室江苏南京211816 江西新瑞丰生化有限公司江西新干331300

赤霉素为植物五大激素之一,对植物生长具有多种生理作用,如调控植物的茎干延长、种子发芽、打破种子休眠、诱导开花等。目前赤霉素已经广泛应用于农业、林业、酿造业等,具有很大经济效益和市场前景。赤霉素的工业化生产主要通过藤仓赤... 详细信息

赤霉素为植物五大激素之一,对植物生长具有多种生理作用,如调控植物的茎干延长、种子发芽、打破种子休眠、诱导开花等。目前赤霉素已经广泛应用于农业、林业、酿造业等,具有很大经济效益和市场前景。赤霉素的工业化生产主要通过藤仓赤霉液体发酵。尽管赤霉素具有多样性的应用及巨大的经济效益,但高生产成本严重制约其广泛的应用。本文首先介绍了赤霉素的生物合成途径以及赤霉素合成基因表达的调控机制,随后重点总结了赤霉素发酵过程的菌种、营养因素、发酵参数、发酵工艺以及下游分离提纯工艺等研究进展。同时指出未来的研究重点在于利用新型的诱变方法与分子生物学方法选育高产菌株以及发酵工艺的革新,以提高赤霉素的产量,降低发酵成本,促进赤霉素的大规模应用。

关键词：赤霉素萜类发酵藤仓赤霉

高活性纤维素酶菌株的筛选鉴定和秸秆降解特性的研究

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高活性纤维素酶菌株的筛选鉴定和秸秆降解特性的研究

作者：曾青兰华中农业大学

学位级别：硕士

农作物秸秆是世界上最丰富的纤维素类物质之一。由于纤维素分子结构的特殊性及纤维素物质在自然界的存在状态(以木质纤维素的形式存在)的特殊性,目前这一巨大资源不仅没有得到充分利用,反而因大部分被焚烧或弃置在自然环境而成了一大污... 详细信息

农作物秸秆是世界上最丰富的纤维素类物质之一。由于纤维素分子结构的特殊性及纤维素物质在自然界的存在状态(以木质纤维素的形式存在)的特殊性,目前这一巨大资源不仅没有得到充分利用,反而因大部分被焚烧或弃置在自然环境而成了一大污染源。如何利用纤维素酶将这些秸秆纤维素废弃物大规模地转化为简单糖类或蛋白质等产品,进一步转化酒精、饲料等已成为全世界研究的热点,也是缓解当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题的有效途经之一。纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。自然界中能分解纤维素的生物主要为真菌类及部分细菌,以木霉、曲霉、青霉的能力最突出,但目前研究得最多的是一些真菌对经物理、化学处理(辐射、蒸汽爆破、膨化、碾磨、酸化、碱化等)的不溶性纤维素的作用,生产成本高,对环境的污染严重,限制了农作物秸秆的高效利用。而筛选性能稳定的高产纤维素酶菌株,研究其对未处理的天然纤维素的降解作用对解决上述这些问题至关重要。我们通过大规模的菌株筛选和测试,取得了以下主要结果: 1.采用CMC-Na平板进行菌种分离,筛选出具有较高降解纤维素酶能力的细菌35株,真菌11株。 2.以天然水稻秸秆为碳源,进行液体摇瓶培养复筛得到一株能高效降解秸秆纤维素的丝状真菌,经18SrDNA基因序列分析和菌株形态特性分析,初步确定该菌株为藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)。 3.以未处理的水稻秸秆为唯一碳源,研究了氮源、接种量、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始pH等对藤仓赤霉产酶的影响.结果表明该菌株产纤维素酶的最适宜的氮源为CO(NH),接种量为5%,培养时间为120 h,培养温度为28～37℃,培养基初始pH为5～6。 ***分析表明,藤仓赤霉作用水稻秸秆是从内表面向外表面进行的;作用前后的稻草成分测定结果显示,纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率分别达38.9%,57.9%和26.5%;该菌对未处理秸秆作用8 d,秸秆失重率可达53%;对该菌的酶成分进行分析,结果表明该菌可产生多种降解酶,其CMCase、FPase、xylanase酶活分别可达1.723 IU/mL、0.344 IU/mL、0.532 IU/mL。且该菌产生的CMC酶的反应温度以50℃左右为宜,pH值以6左右为适,Mg与Ca对酶反应有促进作用,Pb和Cu对酶反应有抑制作用。本实验所获得的藤仓赤霉对水稻秸秆的这些作用特性未见其他作者报道,因此,为进一步利用该菌进行改良、提高酶活以应用于生产奠定了基础。

关键词：纤维素酶筛选藤仓赤霉酶活力秸秆产酶条件酶学性质