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作者：王丹河北医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔扁平苔藓(Oral Lichen Planus, OLP)是常见的口腔黏膜病,病因不明,发病机制尚不完全清楚,可能是遗传、环境及生活方式等多因素间的相互作用的结果。2 %～3 %的患者可发生恶变[1]。OLP患者的上皮萎缩性改变和慢性迁延病程都与... 详细信息

目的:口腔扁平苔藓(Oral Lichen Planus, OLP)是常见的口腔黏膜病,病因不明,发病机制尚不完全清楚,可能是遗传、环境及生活方式等多因素间的相互作用的结果。2 %～3 %的患者可发生恶变[1]。OLP患者的上皮萎缩性改变和慢性迁延病程都与癌变有着密切关系,部分OLP病损中存在上皮异常增生或局部癌变,WHO将OLP归为癌前状态。目前临床上还没有一种特效疗法能够治愈口腔扁平苔藓,西药治疗常出现一些副作用。近年来,临床上采用中医中药治疗口腔扁平苔藓显示出优势。细胞凋亡和细胞增殖的失调都导致恶性肿瘤的发生。如何及早发现癌前病变的高危相,如何找到一个可靠而且客观简便的方法指导临床治疗,进行预后判断和癌变危险性的估计,选择有效的治疗措施,已成为口腔临床医学领域的重要课题。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一种36KD核蛋白,是DNA聚合酶的辅助蛋白,对细胞增殖的启动有重要作用。现已证实,PCNA在细胞周期的G1期开始升高,在S期即合成期达到最高峰,在M期即有丝分裂期降到最低。已发现,其在肺癌、膀肤癌及胃癌中可作为独立的指标。随着人们对PCNA的广泛研究和认识,PCNA作为检测肿瘤细胞增殖的一个指标己日趋成熟。我们在以往的临床实践中应用中药藓化饮治疗口腔扁平苔藓取得了良好的临床效果。为了探讨藓化饮的作用机制,我们采用DispaseⅡ及胰酶消化法,以临床上弃去的正常黏膜为供体,进行人口腔黏膜上皮细胞的原代培养及传代培养,并将藓化饮作用于培养体系中,观察藓化饮提取液对口腔黏膜上皮细胞的作用,探讨藓化饮的作用机制,并为藓化饮治疗口腔扁平苔藓提供理论依据。同时,采用免疫组织化学的方法检测口腔扁平苔藓和口腔高分化鳞癌组织中PCNA的表达及相互关系,以探讨PCNA在口腔扁平苔藓发生、病程进展过程中的作用。方法:1体外培养口腔黏膜上皮细胞原代培养:口腔黏膜来自经患者同意后,健康供者(7-28岁)黏液腺囊肿切除术周边弃去的黏膜组织及完全埋伏的阻生齿上覆盖的正常牙龈黏膜。组织立即保存于无菌PBS液中,半小时内移入超净工作台。PBS洗净血迹,新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合消毒10min。放入0.25%的DispaseⅡ中4℃下消化16～20h后,分离上皮。在0.125%胰蛋白酶与0.02% EDTA(1:1)的混合消化液中37℃下消化5～8 min,终止消化,离心,弃上清,在K- SFM中重悬,计数,置37℃5%CO2细胞培养箱中静置培养。传代培养:当细胞达到80%～90%汇合时,吸去培养液,0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA(1:1)消化细胞无血清培养基重悬细胞沉淀,细胞悬液以1:2的比例接种于培养瓶中继续培养。来源鉴定:取第2代生长良好的上皮细胞,接种于无菌六孔板中的盖玻片上,放入37℃5%细胞培养箱中孵育,细胞长满玻片时取出,PBS中漂洗。95%乙醇固定15min, PBS漂洗,作为实验组和空白对照,进行鼠抗人单克隆角蛋白抗体(AE1/AE3)免疫组化染色。在人口腔黏膜上皮消化后,将揭去上皮后剩余的上皮下组织进行组织块法培养成纤维细胞,爬片,实验方法同实验组,作为阴性对照。实验组和阴性对照滴加一抗工作液(效价1:80),空白对照滴加PBS。光学显微镜下观察,细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性,即可证明其为外胚层来源的上皮细胞。2藓化饮对口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响藓化饮提取液的制备:将黄柏、佩兰、砂仁、赤芍等草药按一定比例混合,水提醇沉法制成质量浓度为每ml含1 g生药的药液,脱色、过滤。用K-SFM稀释为10μg/ml, 100μg/ml, 500μg/ml, 1000μg/ml 4种不同浓度的藓化饮提取液。MTT法检测上皮细胞的增殖活性:取生长良好的第2代培养的口腔黏膜上皮细胞,接种于96孔板,随机分为4个实验组和1个对照组,每组选5个孔。孵育3d后实验组加入无血清培基稀释的4个浓度梯度的藓化饮提取液,对照组加入无血清培基,继续培养5d后,MTT法酶联免疫检测仪在492nm波长下检测各孔OD值,分析藓化饮提取液对上皮细胞增殖活性的影响。3免疫组化染色法检测口腔扁平苔藓组织中PCNA的表达选取河北医科大学第四医院病理科2002-2008年存档的蜡块和口腔科活检或手术切取的组织(经10%福尔马林固定,石蜡包埋)标本共80例,其中口腔扁平苔藓50例,口腔高分化鳞状细胞癌20例,口腔正常黏膜10例。采用免疫组化方法检测口腔扁平苔藓组织、口腔高分化鳞状细胞癌组织、口腔正常黏膜组织中PCNA的表达情况,并分析对比三者之间是否存在差别。同时,分析对比扁平苔藓伴有鳞状上皮增生组织与不伴有鳞状上皮增生组织PCNA的表达情况;分析对比伴有糜烂的扁平苔藓组织与

关键词：细胞培养口腔黏膜上皮细胞藓化饮增殖无血清培养基增殖细胞核抗原(PCNA)

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藓化饮对DMBA诱导的金黄地鼠颊黏膜癌前病变逆转作用的实验研究

藓化饮对DMBA诱导的金黄地鼠颊黏膜癌前病变逆转作用的实验研究

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作者：安智广河北医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔黏膜癌前病变是一种癌前状态,表现为口腔黏膜上皮细胞出现不同程度的不典型增生,但尚未发展成癌。新的WHO分类中指出癌前病变的最新定义为:“转变为鳞状细胞癌的可能性增加的发生改变的上皮。这种改变的上皮出现各种传统上称... 详细信息

目的:口腔黏膜癌前病变是一种癌前状态,表现为口腔黏膜上皮细胞出现不同程度的不典型增生,但尚未发展成癌。新的WHO分类中指出癌前病变的最新定义为:“转变为鳞状细胞癌的可能性增加的发生改变的上皮。这种改变的上皮出现各种传统上称为上皮异常增生的细胞学和组织结构的变化”。目前公认的癌前病变和癌前状态包括白斑、红斑、扁平苔藓和口腔黏膜下纤维性变等。癌前病变如果不能及时治疗而任其发展,最终会发展成癌,严重影响治疗效果和预后,也给患者的生理及心理造成巨大影响。如何对口腔黏膜癌前病变进行治疗,阻断其向口腔癌发展,已经成为当前研究的热点。目前针对口腔黏膜癌前病变的治疗方法较多,主要有西药口服、全身及局部应用激素和免疫抑制剂、早期手术切除及中药治疗等。但应用西药疗效不稳定,激素及免疫抑制剂初期起效虽快但作用不持久且副作用大,而以往的中药治疗多结合局部激素应用,单纯应用中药治疗癌前病变的报道较少,缺乏足够的实验研究来证实中药的治疗效果。针对口腔黏膜癌前病变的特点,中医中药在治疗口腔黏膜癌前病变方面具有明显的优势:中药标本同治、疗效稳固;口服汤剂或中成药制剂,服用方法简便,患者的依从性好,易于接受;与西药相比副作用小等。鉴于以上的优势,中药在治疗癌前病变方面越来越受到人们的重视。本实验采用中药藓化饮对实验动物口腔黏膜癌前病变进行治疗干预,并通过流式细胞术和免疫组化方法观察治疗前后P53和COX-2表达情况,分析和探讨藓化饮对口腔黏膜癌前病变的逆转作用。为今后临床应用提供实验理论依据。方法:1.口腔黏膜癌前病变动物模型制备及分组取叙利亚金黄地鼠(SPF级)55只,6～8周龄,体长约10cm,体重90～110g,雌雄兼备,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证编号:SCXK(京)2007-0001。按照完全随机化原则分为四组:空白对照组5只,癌前病变对照组10只,生理盐水治疗对照组10只,藓化饮治疗组30只。空白对照组每日正常饲养,不做处理,直至实验结束,与其余组一同处死并取材。癌前病变对照组、生理盐水治疗对照组、藓化饮治疗组均以0.5%DMBA涂抹双侧颊黏膜,每周三次,持续六周。2.中药藓化饮煎剂的制备先向组方中药中加入约8～10倍的水,浸泡40分钟～1小时,用武火加热20～30分钟至煮沸,保持约10分钟,再以文火煎约10分钟后,过滤,取汁;再加入相当于剩余滤渣量6倍的水,用武火加热20～30分钟至煮沸,用文火煎约10分钟,加入砂仁,再煎约6～8分钟,过滤,弃去滤渣。合并两次药液,浓缩直到需要的药液量(含生药1g/ml),分装,消毒,4℃储存备用。3.治疗方法生理盐水治疗对照组、藓化饮治疗组分别以生理盐水和中药藓化饮汤剂灌胃治疗,1.6ml/只,每天一次,持续八周,处死全部动物并取材,固定,镜检。4.免疫组化法检测P53及COX-2在各组中的表达取各组蜡块,常规石蜡切片,脱蜡至水,按照S-P试剂盒操作说明进行操作,镜下观察空白对照组,癌前病变对照组,生理盐水治疗对照组及藓化饮治疗组中的P53和COX-2的表达情况,并分析对比各组之间的表达情况是否存在差别,以评价中药藓化饮对口腔黏膜癌前病变的逆转作用。5.流式细胞术石蜡包埋组织在切片机上连续切取40-50μm厚的组织片5-8片,放入试管中;二甲苯脱蜡,梯度酒精水化;生理盐水冲洗,120目铜网轻搓组织,收集单细胞悬液;500目尼龙网过滤,离心,1000rpm,5分钟;加入一抗工作液,室温下静置40分钟;加入二抗工作液,室温下静置1小时;机检,读取结果。6.统计学方法所有采用SPSS 13.0统计软件,等级资料应用秩和检验方法分析,计量资料以均数±标准差(±S)表示,应用单因素方差分析对P53及COX-2检测结果进行统计学分析,α=0.05,P藓化饮治疗组50例标本中,随机抽取10例标本在光镜下观察,均发现上皮分层不规则,基底细胞极性丧失,滴状钉突,细胞核多形性,核质比例增加,细胞核增大,不典型分裂像,核仁增大、数量增加及核深染等不典型增生表现,可说明癌前病变模型制备成功。2.免疫组化2.1 P53在空白对照组中阴性表达;在癌前病变对照组及生理盐水治疗对照组中均为强阳性表达;在藓化饮治疗组中为弱阳性表达。各组间差异有统计学意义,癌前病变对照组和生理盐水治疗对照组间差异无统计学意义。2.2 COX-2在空白对照组中阴性表达;在癌前病变对照组及生理盐水治疗对照组中均为强阳性表达;在藓化饮治疗组中为弱阳性表达。各组间差异有统计学意义,癌前病变对照组和生理盐水治疗对照组间差异无统计学意义。

关键词：癌前病变金黄地鼠藓化饮 P53 COX-2

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超微结构及免疫组化染色下观察藓化饮对金黄地鼠颊黏膜癌前病变的逆转作用

超微结构及免疫组化染色下观察藓化饮对金黄地鼠颊黏膜癌前病变的...

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作者：仇永乐河北医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔黏膜癌前病变与口腔癌的发生密切相关,近些年来,为了降低口腔癌的发病率,人们越来越重视对口腔黏膜癌前病变的预防和治疗。目前,口腔黏膜癌前病变的治疗手段较多,主要分为药物治疗和非药物治疗。非药物治疗如手术治疗、激光治... 详细信息

目的:口腔黏膜癌前病变与口腔癌的发生密切相关,近些年来,为了降低口腔癌的发病率,人们越来越重视对口腔黏膜癌前病变的预防和治疗。目前,口腔黏膜癌前病变的治疗手段较多,主要分为药物治疗和非药物治疗。非药物治疗如手术治疗、激光治疗、冷冻治疗等等,有着适应证的局限性。而西药治疗如:增生平、维甲酸等等,长期服用可能会出现一些毒副作用。近年来研究表明,中医中药治疗口腔黏膜癌前病变显示出明显的临床效果,也成为目前口腔黏膜癌前病变研究的热点。本课题通过建立口腔黏膜癌前病变动物模型,应用电镜和免疫组化的方法观察中药藓化饮对口腔黏膜癌前病变的逆转作用。方法:选取SPF级LVG叙利亚金黄地鼠55只,鼠龄六周,体质量80g。按完全随机设计方法将动物分为:空白对照组5只和实验组50只。实验组用于建立口腔黏膜癌前病变动物模型,其中又分为癌前病变对照组10只、藓化饮治疗组30只、生理盐水治疗对照组10只。将实验组50只动物,颊囊黏膜涂以0.5%DMBA丙酮溶液,每周3次,连续涂药6周后,藓化饮治疗组、生理盐水治疗对照组分别灌胃治疗。治疗8周时,各组同步取材。采用电镜及免疫组化方法,观察中药藓化饮对金黄地鼠颊黏膜癌前病变的逆转作用。结果: 1癌前病变动物模型的建立实验组50只动物颊黏膜致癌六周后,双侧颊黏膜肉眼观全部为充血、糜烂、条索状皱折等表现。随机切取10例不同肉眼表现的部分病变部位,HE染色后观察,上皮黏膜表现为不同程度的异常增生。由此说明,经DMBA丙酮溶液致癌六周后,已成功建立金黄地鼠颊黏膜癌前病变的动物模型。 2藓化饮对叙利亚金黄地鼠口腔黏膜癌前病变的逆转作用 2.1肉眼观察空白对照组金黄地鼠颊黏膜表面光滑,呈淡粉色,透亮具有弹性,血管清晰。实验组50只动物涂DMBA丙酮溶液六周后,颊黏膜变得粘连、粗糙、无弹性、充血糜烂,甚至可见条索状皱折。中药藓化饮灌胃八周后,可见颊黏膜皱折减轻,黏膜表面逐渐光滑,充血糜烂面基本消失,但弹性较正常稍差。生理盐水灌胃治疗八周后与治疗前无明显改变。 2.2光镜观察空白对照组金黄地鼠颊黏膜为角化的复层鳞状上皮,上皮和肌层之间为薄层结缔组织及少量散在的纤维细胞和血管。停涂DMBA丙酮溶液八周后,镜下观察金黄地鼠颊黏膜可见不同程度的异常增生。中药藓化饮灌胃治疗八周后,黏膜上皮层次逐渐清晰,上皮层数逐渐恢复正常,基底层细胞排列比较有规则,异型性的细胞减少。生理盐水灌胃治疗八周后与治疗前无明显改变。 2.3扫描电镜观察空白对照组金黄地鼠颊黏膜上皮表现为多边形细胞,细胞间桥很明显,个体细胞表面显示很多网状排列的微嵴,微嵴围成均匀一致的小窝,整个细胞表面呈现一种蜂窝状外观。停涂DMBA丙酮溶液八周,细胞外形更不规则,细胞重叠,松解现象更为突出,微嵴肿胀变宽,不规则排列,呈卵石状外观,蜂窝状结构完全消失。中药藓化饮灌胃治疗八周后,细胞外形逐渐清晰,呈现出多边形。细胞表面大部分区域呈现蜂窝状结构,可见连续的细胞界限。生理盐水灌胃治疗八周与治疗前无明显改变。 2.4透射电镜观察空白对照组金黄地鼠颊黏膜上皮细胞外形规则,细胞紧密相邻,桥粒丰富,张力纤维发育正常,基底膜完整。停涂DMBA丙酮溶液八周后,可见细胞间隙增宽,桥粒大量减少,张力纤维减少,细胞外形不规则,核仁边集,核外形不规则,核膜内陷,可见基底膜断裂。中药藓化饮灌胃治疗八周后,增宽的细胞间隙逐渐减小,桥粒和张力纤维逐渐丰富,细胞外形逐渐规则。生理盐水灌胃治疗八周与治疗前无明显改变。 3藓化饮治疗后EZH2、PCNA在各组免疫组化染色结果 EZH2、PCNA在空白对照组和藓化饮治疗组低表达,而在癌前病变对照组和生理盐水治疗对照组高表达。癌前病变对照组EZH2、PCNA高表达率与空白对照组相比,有显著性差异(P藓化饮治疗组EZH2、PCNA高表达率与癌前病变对照组相比,有显著性差异(P藓化饮治疗组EZH2、PCNA高表达率与空白对照组相比,无显著性差异(P>0.05);生理盐水治疗对照组EZH2、PCNA高表达率与藓化饮治疗组相比,有显著性差异(P藓化饮治疗八周后,叙利亚金黄地鼠颊黏膜充血糜烂面基本消失,细胞外形逐渐清晰,上皮层异型性的细胞减少,EZH2、PCNA高表达率明显下降。说明藓化饮对金黄地鼠颊黏膜癌前病变有明显逆转作用。

关键词：口腔癌前病变叙利亚金黄地鼠藓化饮扫描电镜透射电镜 EZH2 PCNA

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藓化饮治疗金黄地鼠颊黏膜癌前病变前后EZH2、PCNA的表达及意义

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口腔医学 2010年第7期30卷 394-398页

作者：许彦枝仇永乐田晓玲杨凤英安智广河北医科大学第四医院口腔科石家庄050011

目的探讨EZH2、PCNA在金黄地鼠颊黏膜癌前病变藓化饮治疗前后的表达及意义。方法按完全随机设计方法,将动物分为空白对照组5只和实验组50只。实验组用于建立金黄地鼠颊黏膜癌前病变模型,其中30只为藓化饮治疗组;10只为癌前病变对照组;1... 详细信息

目的探讨EZH2、PCNA在金黄地鼠颊黏膜癌前病变藓化饮治疗前后的表达及意义。方法按完全随机设计方法,将动物分为空白对照组5只和实验组50只。实验组用于建立金黄地鼠颊黏膜癌前病变模型,其中30只为藓化饮治疗组;10只为癌前病变对照组;10只为生理盐水治疗对照组。治疗8周时,各组同步取材。采用免疫组化方法,光镜下观察EZH2、PC-NA在金黄地鼠颊黏膜癌前病变藓化饮治疗前后的表达情况。结果癌前病变对照组EZH2、PCNA高表达率与空白对照组相比,有显著性差异(P藓化饮治疗组EZH2、PCNA高表达率与癌前病变对照组相比,有显著性差异(P藓化饮治疗组EZH2、PCNA高表达率与空白对照组相比,无显著性差异(P>0.05);生理盐水治疗对照组EZH2、PCNA高表达率与藓化饮治疗组相比,有显著性差异(P藓化饮对金黄地鼠颊黏膜癌前病变具有明显的逆转作用。

关键词： EZH2 PCNA 口腔癌前病变金黄地鼠藓化饮

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藓化饮对口腔扁平苔藓患者激活调节因子表达的影响

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山东中医杂志 2009年第1期28卷 13-14页

作者：许彦枝辛晓红刘亚娴刘挺立王丹河北医科大学第四医院河北石家庄050011 河北省保定市第一中心医院河北保定071000 山东中医药大学附属医院山东济南250011

目的:探讨藓化饮对口腔扁平苔藓(OLP)患者激活调节因子(RANTES)表达的影响及临床疗效。方法:选取30例OLP患者(治疗组)和24例健康人(对照组),治疗组采用藓化饮治疗,ELISA法检测对照组和治疗组应用藓化饮治疗前及治疗8周后血清RANTES的表... 详细信息

目的:探讨藓化饮对口腔扁平苔藓(OLP)患者激活调节因子(RANTES)表达的影响及临床疗效。方法:选取30例OLP患者(治疗组)和24例健康人(对照组),治疗组采用藓化饮治疗,ELISA法检测对照组和治疗组应用藓化饮治疗前及治疗8周后血清RANTES的表达观察疗效;比较OLP患者与健康人RANTES表达的不同。结果:OLP患者经藓化饮治疗8周后,自觉症状有不同程度的改善,其中痊愈13例,显效11例,有效5例,无效1例,总有效率96.7%。OLP患者组血清中的趋化因子RANTES含量高于对照组,两组比较有显著性差异(P藓化饮可调节OLP患者的免疫功能,促进病情的好转。

关键词：口腔扁平苔藓分泌激活调节因子藓化饮临床研究

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中药藓化饮对金黄地鼠颊囊粘膜癌前病变的逆转作用

中药藓化饮对金黄地鼠颊囊粘膜癌前病变的逆转作用

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第五届全国中医药免疫学术研讨会——暨环境·免疫与肿瘤防...

作者：许彦枝仇永乐河北医科大学第四医院口腔科

口腔粘膜癌前病变是指口腔内的某些慢性病灶,如长期的溃疡、白斑、红斑等。这些慢性病灶虽然本身不是癌,但如果不及早治疗,又伴随各种不良刺激就有可能发生癌变。所以,为了降低口腔癌的发病率,应对口腔癌前病变进行早期的发现和及时治... 详细信息

口腔粘膜癌前病变是指口腔内的某些慢性病灶,如长期的溃疡、白斑、红斑等。这些慢性病灶虽然本身不是癌,但如果不及早治疗,又伴随各种不良刺激就有可能发生癌变。所以,为了降低口腔癌的发病率,应对口腔癌前病变进行早期的发现和及时治疗。目前,口腔癌前病变的治疗方法虽多,但无特效疗法,主要治疗方法有药物治疗、物理治疗、手术治疗。药物治疗仍是被认同和探讨最多的治疗方法。本研究通过建立金黄地鼠颊囊粘膜癌前病变模型,采用中药藓化饮干预治疗,探讨中药藓化饮对口腔颊囊粘膜癌前病变的逆转作用,为指导临床应用中草药防治口腔粘膜癌前病变提供实验依据。材料和方法

关键词：藓化饮口腔癌前病变金黄地鼠颊囊粘膜

来源： cnki会议评论

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