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从烟草悬浮细胞中分离液泡前体的方法研究

深圳大学学报（理工版） 2005年第2期22卷 109-112页

作者：莫蓓莘姜里文深圳大学生命科学学院深圳518060 香港中文大学生物系

通过跟踪含有液泡前体特异标记物的组分, 利用细胞壁酶水解胞壁制造原生质体, 并用真针头挤压的方法裂解细胞, 用蔗糖密度梯度离心的方法分离液泡前体. 通过相差显微镜观察, 发现所分离的液泡前体保持完整的结构. 利用不同细胞器的标记... 详细信息

通过跟踪含有液泡前体特异标记物的组分, 利用细胞壁酶水解胞壁制造原生质体, 并用真针头挤压的方法裂解细胞, 用蔗糖密度梯度离心的方法分离液泡前体. 通过相差显微镜观察, 发现所分离的液泡前体保持完整的结构. 利用不同细胞器的标记物抗体进行免疫标记检测, 证明所纯化的液泡前体不含其他细胞器, 具有较高的纯度.

关键词：前体液泡分离悬浮细胞蔗糖密度梯度离心烟草显微镜观察原生质体免疫标记标记物细胞器酶水解细胞壁

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斑点叉尾病毒(CCV)结构蛋白的鉴定

湖北农业科学 2012年第21期51卷 4841-4845页

作者：毕鹏吴志新苏念李莉娟华中农业大学水产学院武汉430070

采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研... 详细信息

采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供了参考。

关键词：斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV) 结构蛋白蔗糖密度梯度离心质谱

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鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

湖北农业科学 2005年第3期44卷 94-95,103页

作者：陈萍王红宁陈俊杰胡慧琼周生余祖华四川农业大学动物科技学院四川雅安625014

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,... 详细信息

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,在电镜下能观察到典型的冠状病毒形态,病毒粒子直径为80～120nm,有囊膜、纤突。应用反转录-聚合酶链式反应穴RT-PCR雪技术扩增出了该病毒的特异性基因M和N,这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。

关键词：鸡肾型传染性支气管炎病毒分离鉴定鸡传染性支气管炎病毒蔗糖密度梯度离心聚合酶链式反应特异性基因鸡胚接种发病鸡群 10日龄差速离心病毒形态粒子直径分子水平不连续尿囊液反转录雏鸡花斑

褐藻裙带菜中PSII复合物及其亚复合物的分离和特性研究

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植物生理学通讯 2006年第5期42卷 841-846页

作者：陈敏邢克克李爱芬周百成山东烟台大学生物化学系山东烟台264005 暨南大学水生生物研究中心广州510632 中国科学院海洋研究所山东青岛266071

用不连续梯度蔗糖密度超离心,从经TritonX-100增溶的褐藻裙带菜类囊体膜中分离到3种色素蛋白复合物条带,分别是捕光复合物、具有光氧化活性的PSII复合物颗粒(区带II)以及PSI(区带III)。PSII颗粒经毛地黄皂苷增溶后,再次超离心分离得到3... 详细信息

用不连续梯度蔗糖密度超离心,从经TritonX-100增溶的褐藻裙带菜类囊体膜中分离到3种色素蛋白复合物条带,分别是捕光复合物、具有光氧化活性的PSII复合物颗粒(区带II)以及PSI(区带III)。PSII颗粒经毛地黄皂苷增溶后,再次超离心分离得到3条PSII的亚复合物条带。吸收和荧光激发谱显示其中的区带II-1为墨角藻黄素-Chla/c-蛋白复合物,区带II-2为Chla/c-蛋白复合物,两者都只含20kDa多肽;而鲜绿色的区带II-3为不含捕光复合物的活性PSII核心。

关键词：裙带菜蔗糖密度梯度离心 PSⅡ PSⅡ核心捕光复合物多肽

喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取和鉴定

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2015年第4期22卷 170-172页

作者：吉晓滨梁俊毅刘启才谢景华广州市第一人民医院耳鼻咽喉科广东广州510180 广州医科大学实验医学研究中心广东广州510182

目的观察喉癌Hep-2细胞能否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定。方法大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清液。通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,利用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度... 详细信息

目的观察喉癌Hep-2细胞能否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定。方法大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清液。通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,利用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度离心法,将上清液浓缩提纯,透射电镜对exosomes做鉴定。结果成功从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes,电镜下观察exosomes呈圆形或椭圆形双层膜的囊泡状结构,直径约20~100 nm,密度较高,分散均匀。结论较先发现喉癌细胞自身能分泌exosomes,为喉癌免疫治疗做新的探求。

关键词：肿瘤,鳞状细胞细胞,培养的显微镜检查,电子,透射蔗糖密度梯度离心超滤离心

蓝隐藻藻蓝蛋白—叶绿素蛋白复合物的分离及其结构与性质的研究

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蓝隐藻藻蓝蛋白—叶绿素蛋白复合物的分离及其结构与性质的研究

作者：王扬烟台大学

学位级别：硕士

本文探索了蓝隐藻的实验室培养以及大规模制备类囊体膜的条件;建立并优化了叶绿素-蛋白复合物的去污剂增溶以及蔗糖密度梯度离心分离的方法,稳定分离到4种活性的叶绿素蛋白复合物,包括2种捕光复合物及PSⅠ和PSⅡ颗粒各1种;又对2种捕光... 详细信息

本文探索了蓝隐藻的实验室培养以及大规模制备类囊体膜的条件;建立并优化了叶绿素-蛋白复合物的去污剂增溶以及蔗糖密度梯度离心分离的方法,稳定分离到4种活性的叶绿素蛋白复合物,包括2种捕光复合物及PSⅠ和PSⅡ颗粒各1种;又对2种捕光复合物及PSⅡ颗粒分别进行了二次增溶,分别采用蔗糖密度超离心和等电聚焦方法分离,共得到5种叶绿素蛋白亚复合物,并对所得各种复合物和亚复合物的吸收光谱、荧光光谱、光氧化活性、多肽组成以及等电点等特性进行了的测定和分析。结果显示,两种捕光复合物分别是小颗粒的外周捕光色素蛋白复合物(主要含有20、24KD多肽)和包含内周和外周天线成分在内的大的捕光复合物颗粒(等电点为pH5.3.8,主要含有19、24、28、37、42、70KD多肽);PSⅡ颗粒则包含PSⅡ核心(等电点为pH5.9,主要含有24KD多肽)以及内周天线两种亚复合物(等电点为pH6.4,主要含有56、37、30、20、16KD多肽)。经静态和动态荧光动力学以及多肽分析证实,大的捕光复合物颗粒(带Ⅱ)、PSⅡ颗粒(带Ⅲ)以及捕光亚复合物颗粒(带Ⅱ-2)和PSⅡ核心复合物(带Ⅲ-2)是活性的蓝隐藻藻蓝蛋白-叶绿素蛋白复合物;藻蓝蛋白与捕光复合物及PSⅡ核心的结合不具有结构上的倾向性;其吸收的能量向PSⅡ的传递可经由Chla/c-蛋白复合物介导,也可以不依赖其介导。根据上述结果,最终构建了蓝隐藻叶绿素蛋白复合物之间以及叶绿素蛋白与藻蓝蛋白之间的结构关系图。

关键词：蓝隐藻类囊体膜蔗糖密度梯度离心藻蓝蛋白-叶绿素蛋白复合物 PSⅡ结构

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鼠肝质膜蛋白质组方法学研究

鼠肝质膜蛋白质组方法学研究

作者：魏颖娟湖南师范大学

学位级别：硕士

本文以鼠肝质膜为研究对象，旨在优化提取、纯化以及鉴定质膜蛋白质的方法。主要进行了两个方面的实验：(1)纯化鼠肝质膜蛋白质方法学研究;(2)肝质膜蛋白质组研究中染色方法比较及优化。第一方面的实验以鼠肝为材料，采用两步蔗糖密度... 详细信息

本文以鼠肝质膜为研究对象，旨在优化提取、纯化以及鉴定质膜蛋白质的方法。主要进行了两个方面的实验：(1)纯化鼠肝质膜蛋白质方法学研究;(2)肝质膜蛋白质组研究中染色方法比较及优化。第一方面的实验以鼠肝为材料，采用两步蔗糖密度梯度离心法纯化质膜，用扫描电镜分析检测质膜纯度，1DE、2DE分离质膜蛋白质，且PDQuest软件分析图谱。从不同纯化步骤得到的膜蛋白质的电泳图谱中找出82个不同的蛋白质点，然后对其进行酶解和质谱分析，最后共鉴定到56个蛋白质，其中有43个是在PDQuest软件中定义为2倍差异的点。从蛋白质定位信息中可以看出其中有35个2倍差异的点，是定位于质膜上的蛋白质;另外7个2倍差异点，5个为线粒体蛋白、2个为过氧化物酶体蛋白。此外13个无明显差异的蛋白质点由于定位信息不明确，推测为质膜与其它细胞器共定位的蛋白质。以上结果说明两步蔗糖密度梯度提取有利于质膜蛋白的富集。然后探索了几种新方法(双水相，高盐高pH结合双水相，双水相结合蔗糖密度梯度)对质膜蛋白质进行了富集。研究结果表明：高盐高pH结合双水相，以及双水相结合蔗糖密度梯度的方法都能较好地富集整合膜蛋白质，其中双水相结合蔗糖密度梯度的方法又优于高盐高pH结合双水相处理。将所提取的蛋白质用1DE-PAGE分离，ESI-Q-TOF质谱鉴定。鉴定的结果表明双水相和蔗糖密度梯度离心作为两种不同的提取及纯化质膜的方法的结合使用，可以进一步纯化质膜得到更好的分离效果。为了提高组织细胞质膜的纯度，研究中还摸索使用了一种新的亲和法纯化组织质膜。即用抗体磁珠免疫亲和分离纯化C57小鼠肝脏质膜的方法。与密度梯度离心法相比，质膜富集了3倍左右，线粒体减少了约2倍。同时比较了四种亲和提取方式，优化了样品、磁珠以及抗体之间量的比例。研究鉴定的质膜或质膜相关蛋白质的比例明显高于使用其它方法得到的质膜蛋白质的比例。第二方面，对鼠肝质膜蛋白质组进行了5种染色方法的比较实验，发现荧光染色的质谱鉴定准确性高于快速银染法，快速银染法又高于普通银染法。考染中G-250的效果比R-350好，且背景低、快速。对考染后切取了高丰度蛋白质点后的胶块进行快速银染，既可以提高鉴定的准确性又可以不丢失低丰度的蛋白质。

关键词：纯化质膜蛋白质蔗糖密度梯度离心双水相二抗磁珠染色方法

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流感裂解灭活疫苗纯化工艺的开发

流感裂解灭活疫苗纯化工艺的开发

作者：杜丽娟大连理工大学

学位级别：硕士

流感病毒具有高度的传染性，并能引起急性呼吸道传染疾病，它的流行特点是在短期内突然爆发，迅速蔓延，造成不同程度的流行，其中包括世界大流行、局部流行暴发及散发。它的发病率极高，并伴有很高的死亡率。目前尚无特效药，接种流感... 详细信息

流感病毒具有高度的传染性，并能引起急性呼吸道传染疾病，它的流行特点是在短期内突然爆发，迅速蔓延，造成不同程度的流行，其中包括世界大流行、局部流行暴发及散发。它的发病率极高，并伴有很高的死亡率。目前尚无特效药，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法。本文首先将HN、HN、B三种不同型别的流感病毒(Influenza virus)分别接种于普通鸡胚，经培养后，收获其病毒原液，然后进行超滤浓缩、纯化、裂解、二次纯化及灭活等步骤，最后将三种型别的病毒液合并，制成疫苗，确定了一套较完整的流感裂解灭活疫苗工艺。同时对该工艺中的两种纯化方法—蔗糖密度梯度离心与Sepharose4FF层析进行了摸索、比较，最后从产业化角度考虑，确定了较佳的生产工艺。对两种不同纯化方法得到的病毒原液进行质量分析，结果表明：用两种方法纯化后的病毒液质量都达到WHO规定的要求。两者均可作为流感疫苗(Influenza Vaccine)的纯化方法。但在卵清蛋白及杂蛋白去除方面，Sepharose 4FF层析法要稍好于蔗糖密度梯度离心。层析法的卵清蛋白去除率可达到99.3％以上，蔗糖密度梯度离心法可达到97.5％上。杂蛋白去除率：Sepharose 4FF层析法的为89.2％以上;蔗糖密度梯度离心法的为87.5％以上。而在回收率方面蔗糖密度梯度离心法为40.7％以上，Sepharose 4FF层析为37.5％以上。由此可见蔗糖密度梯度离心法要高于Sepharose 4FF层析法。在细菌内毒素去除方面，两种方法均达到WHO规定标准，且无大的差别。鉴于产品开发要求，试验研究确定选用蔗糖密度梯度离心方法作为流感疫苗的纯化手段。并对用该法纯化的流感病毒液进行了后序工作的研究，对研制的疫苗成品进行了相关检测，其结果均符合WHO标准要求。

关键词：流感病毒纯化 Sepharose 4FF层析蔗糖密度梯度离心流感疫苗

小麦生理型、遗传型雄性不育系及其对应可育系小花叶绿体蛋白差异的比较研究

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小麦生理型、遗传型雄性不育系及其对应可育系小花叶绿体蛋白差异...

作者：李莉西北农林科技大学

学位级别：硕士

杂种优势是生物界普遍存在的自然现象,作为世界第一大粮食作物,小麦有着明显的杂种优势,如何有效的利用其杂种优势,是我国现阶段提高小麦产量的一条重要途径。目前,小麦生产上杂种优势利用的途径主要有:（1）化学杀雄进行杂交制种;（2... 详细信息

杂种优势是生物界普遍存在的自然现象,作为世界第一大粮食作物,小麦有着明显的杂种优势,如何有效的利用其杂种优势,是我国现阶段提高小麦产量的一条重要途径。目前,小麦生产上杂种优势利用的途径主要有:（1）化学杀雄进行杂交制种;（2）采用雄性不育系进行杂交制种。但其雄性不育机理研究已成为小麦杂种优势利用中的一个科学难关仍在探索之中,近年将其焦点多集中在细胞核和线粒体中一些与育性相关因子的解析与研究。而本试验则以杀雄剂诱导的生理型雄性不育系ms（A）-西农1376、遗传型雄性不育系ms（S）-西农1376及其对应可育系MS（A）-西农1376单核早期的小花为试材,经差速离心结合蔗糖密度梯度离心技术先提纯小花完整叶绿体;然后,通过TCA-丙酮法沉淀蛋白,利用IEF/SDS-PAGE双向电泳技术进行差异蛋白比较;最后胶内酶切进行挖点、生物质谱测序技术以及生物信息学数据库检索技术,对小麦小花在花粉小孢子萌发的单核早期叶绿体蛋白质进行了研究,得出以下重要结果: 1、利用不同方法提取了供试材料单核早期小麦小花叶绿体,经淀粉碘化钾染色压片并结合电子显微镜观察,结果表明完整叶绿体呈棒状或橄榄状并被染成蓝色;而破碎的叶绿体不被染色,杂质含量也很大。 2、经TCA-丙酮沉淀蛋白,7cm,pH3～10的线性预制干胶条进行IEF/SDS-PAGE检测,发现三层蔗糖密度梯度结合差速离心技术所得叶绿体完整性和纯度都高于差速离心技术,以及两层蔗糖密度梯度离心所得的叶绿体;核污染以及线粒体污染大大降低,弥补了单纯差速离心杂质多,以及两层蔗糖密度梯度离心技术高丰度蛋白过多而低丰度蛋白损失严重的缺点。 3、用17cm,pH4～7的线性胶条对小麦ms（A）-西农1376、（A）-西农1376以及ms （S）-西农1376单核早期（花粉小孢子萌发形成单核）小花叶绿体蛋白质组进行比较分析,利用PDQuest软件对图像进行背景消减,斑点检测、匹配,获取斑点位置坐标,并分析计数蛋白点,每个图谱在pH4～7,分子量14.4～94.0KD的范围内,均可以得到130～200个蛋白点,而且大多数蛋白在等电点4.5～7（胶条的碱性端）,分子量10～60KD居多。发现杀雄剂诱导的生理型雄性不育系和对应可育系间叶绿体蛋白差异点不明显,仅有少数差异只是表达量上的差异,其中在生理型雄性不育系中上调表达的蛋白点有5个,下调表达的蛋白点有7个;还有一些不是很明显的微小的质的差异点,在生理性雄性不育系中表达而可育系中没有表达的有8个,丢失的蛋白有2个,但都是不很明显的点。遗传型雄性不育系ms （S）-1376叶绿体蛋白保持系相匹配的蛋白点有150多个,表达上调的蛋白点有4个,下调的蛋白点有18个,在对应可育系中几乎没有表达,而在遗传型雄性不育系中明显特异表达的有15个点,在对应可育系中表达而遗传型不育系中未表达的有14个。两不育系中都表达而在对应可育系中缺失的蛋白有6个,正常可育系和生理型雄性不育系材料中表达而遗传型不育系中未表达的6个点;可育系中下调表达但在两不育系中上调表达的4个点。两种不育系下调表达,可育系中上调表达的点有2个。 4、选取具有代表性的6个差异蛋白点进行质谱测序,获得质量较好的肽指纹图谱（PMF）,用Profound和Mascot软件搜索NCBInr数据库,鉴定结果,Spot1为酰基辅酶A脱氢酶结构域蛋白,Spot3钙调结蛋白磷酸酶,Spot4被鉴定为多催化功能肽酶,Spot5为热休克蛋白60,其中蛋白点41是在拟南芥叶绿体中新发现的未知功能基因表达的蛋白。 5、对已知蛋白的功能进行分析,推测小麦雄性不育可能主要与能量代谢紊乱导致代谢供能不足,信号转导受阻导致细胞抗性减弱,活性氧积累导致细胞中毒,细胞凋亡导致花药发育异常及花粉败育,以及调节花器官发育基因作用失控导致的花丝不伸长或不产生有功能的花粉等有关。这些差异蛋白很可能直接或间接地参与了供试材料育性正常发育与败育的某些关键途径,而供试遗传型雄性不育系和杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系和对应可育系互为等基因或者等生理差异系,其叶绿体蛋白图谱中表现出的差异蛋白很有可能与雄性不育或者SQ-1诱导小麦雄性不育有关。

关键词：小麦小花雄性不育叶绿体蛋白蔗糖密度梯度离心双向电泳技术