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脂筏结构拆离与重建的原子力显微镜研究

脂筏结构拆离与重建的原子力显微镜研究

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作者：郝长春陕西师范大学

学位级别：硕士

目的：通过系统的研究人工制备双层生物膜中卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺的相互作用，从分子动力学角度分析结构形成的原因。研究分子具有的官能团在形成结构中作用，从而为组装生物膜的脂筏结构奠定基础。再通过体外模拟... 详细信息

目的：通过系统的研究人工制备双层生物膜中卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺的相互作用，从分子动力学角度分析结构形成的原因。研究分子具有的官能团在形成结构中作用，从而为组装生物膜的脂筏结构奠定基础。再通过体外模拟和体内分离相结合的方法，从细胞中分离脂筏，对其结构、组成成分、物理性质和化学性质进行研究，探索脂筏结构和功能的生物学特性。方法：1．利用LB技术测试单分子层膜的平均分子面积和表面压力等温线，采用Y型提膜方法保持一定的膜压在新解离的云母片上制备脂双层膜。2．用原子力显微镜检测不同脂成份形成的脂双层膜结构。3．通过蔗糖密度梯度离心，用去垢剂处理质膜样品提取脂筏成份。结果：1．对于单元系统，磷脂酰胆碱单层膜的等温线都表现出明显的相变点，而鞘磷脂、胆固醇没有明显的相变点。原子力显微镜观察到磷脂酰胆碱分子结构容易形成聚团的微区囊泡结构，鞘磷脂则易于形成结构均一的双层膜结构。胆固醇易于聚团，形成片层结构。通过单元系统的实验，熟悉掌握了制备人工双层膜系统，为下一步进行多元系统实验奠定基础。 2．对于二元系统系统，等摩尔配比的鞘磷脂(SM)／磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)／磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)／胆固醇(Chol)表现出不同的结构特征。SM／PC能形成具有周期性的波纹结构，在较大的膜压下能形成圆形的微区结构，飘浮在液态PC上。在膜压最大时，双层膜表现为稳定地片层结构。对于SM／PE组成的系统，在较低膜压下，形成了边界非常明显的微区结构，微区内部两组份形成了聚集体结构。在较大的膜压情况下，形成大片层和紧密的聚集体结构。而SM／Chol则在低膜压下形成均一的结构，云母表面的覆盖率在60％以上，均匀分布，结构鲜明。当在较高膜压时能形成稳定的具有许多孔洞的片层结构。 3．对于三元系统系统，主要研究了等摩尔配比的SM／Chol／PC、SM／Chol／PE和SM／Chol／神经酰胺(Ceramide)混合物的双层膜结构特性。同时研究了不同比例的Chol在SM／PC中的分布。结果表明，SM／Chol／PC能在中间膜压情况下形成圆形的结构微区，SM／Chol形成紧密的液态有序相，大小约为200nm。在膜压较高的情况形成了多孔洞的片层结构。对于SM／Chol／PE不能形成规则的微区结构，易于形成脂质体小泡状结构。而SM／Chol／Ceramide在低膜压下形成均匀的分散的多片层结构，在中间膜压形成了更加紧密聚集的颗粒结构，颗粒表现为中间低边缘高的结构特性，这与提出的脂筏结构相似。当在SM／PC中逐渐加入Chol时，实验发现，胆固醇和带饱和脂肪酸链的磷脂发生相互作用形成微区结构，随着胆固醇含量的增加，微区的面积逐渐增大，形成了稳定的片层结构。在三元系统的基础上，对多元系统的结构进行了观测，研究了不同比例的Ceramide在等摩尔SM／PC／Chol中的分布。随着神经酰胺比例的增加，先形成紧密的聚集态结构，然后逐渐演变成具有特定微区的网状结构。 4．提取细胞脂质成分组装和脂筏分离的结构检测。用蔗糖密度梯度离心法从人血红细胞中分离不溶于去垢剂Triton X-100的膜筏成份。原子力显微镜三维结构测定表明单个脂筏以颗粒聚集体的形式存在，直径约210 nm的扁圆形中间凹陷结构。分离干燥血影成份的LB膜结构表现为稳定的片层和聚集体共存结构，具有特定的结构微区特性。实验数据表明体外进行细胞膜脂筏结构模拟组装与在体分离方面具有相同的结构。结论：LB双层膜的制备与多种因素有关，如温度、pH值、浓度等。不同分子所具有的官能团决定了结构的形成。不同的官能团赋予了分子具有不同的氢键结合能力形成微区结构，在研究系统中，胆固醇与其它分子发生相互作用的优先顺序为：神经酰胺＞鞘磷脂＞磷脂酰胆碱。脂筏颗粒聚集体易形成扁圆形中间凹陷结构，这些微区结构可能在细胞信号传导等生理活动中起到重要的作用。

关键词：原子力显微镜 LB技术脂筏蔗糖密度梯度离心技术

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