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hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达及其表达系统的改进

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hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达及其表达系统的改进

作者：金锐上海师范大学

学位级别：硕士

人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一个被克隆和利用重组DNA技术生产的造血刺激因子，是一个具有多项潜能的造血生长因子，具有十分重要的临床应用价值，在国际生物技术制药市场上占有重要的位置。目前市场上销售的hGM-CSF... 详细信息

人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一个被克隆和利用重组DNA技术生产的造血刺激因子，是一个具有多项潜能的造血生长因子，具有十分重要的临床应用价值，在国际生物技术制药市场上占有重要的位置。目前市场上销售的hGM-CSF多是由大肠杆菌作为宿主生产的，由于其过表达及含内毒素的缺点，人们曾尝试在酵母、哺乳细胞、昆虫细胞、植物细胞中表达hGM-CSF，但或多或少都有一些缺陷。而蓝藻作为新兴的制备基因工程药物的宿主具有遗传背景简单，便于外源基因转化、蛋白酶活性低、培养基低廉、不含内毒素等优点，是制备基因工程药物的很有潜力的宿主。本文在利用鱼腥藻7120作为宿主成功表达hGM-CSF基因的基础上，对克隆到的hGM-CSF进行修饰，在基因的5’端添加了可以在蓝藻中高效表达的SD序列，并将SD序列与起始密码子ATG之间的距离调整为相差6个碱基，然后将hGM-CSF基因插入到中间载体pRL-439强启动子PpsbA的下游，得到中间表达载体pRL-GMs，进一步插入到穿梭载体pDC-08的相应位点，构建成穿梭表达载体pDC-GMs。利用三亲接合转移法转化鱼腥藻7120，通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到含有目的基因的转基因藻GMs藻株。并对转基因藻的最适生长条件进行了优化筛选。同时本文还针对我们前期所构建的穿梭表达载体系统存在稳定性欠佳，质粒易丢失的特点，所以又克隆了鱼腥藻7120中编码谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因，将其作为整合平台，插入到pRL-721中的hGM-CSF基因和强启动子PpsbA的上游，构建成了整合载体pRG-GM。为提高hGM-CSF基因在鱼腥藻7120中的表达效率和提高外源基因在鱼腥藻7120中的稳定性提供了资料。本论文的主要内容及结果如下： 1．克隆hGM-CSF基因，在5’端添加SD序列，并调整SD序列与ATG间距离，然后将其插入强启动子PpsbA的下游，克隆到穿梭载体pDC-08的相应位点，构建成穿梭表达载体pDC-GMs，然后利用三亲接合转移转化鱼腥藻7120，通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到含有目的基因的转基因藻GMs藻株;转基因藻DNA水平检测，表明hGM-CSF已经转入GMs藻株中;Western Blot分析表明，在转基因藻中表达了具有免疫活性的hGM-CSF。 2．通过对转基因藻的最适生长条件测定发现，转基因藻株的最适生长温度为30℃，最适pH值为9.5～10.5，在调整了环境因子的基本培养基中，GMs藻株与野生

关键词：蓝藻基因工程人粒-巨噬细胞集落刺激因子鱼腥藻7120 三亲接合移 SD序列转基因藻同源重组

egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

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egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

作者：康升云上海师范大学

学位级别：硕士

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始,越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展,有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是,外源基因表... 详细信息

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始,越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展,有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是,外源基因表达效率低下的瓶颈制约了蓝藻基因工程的发展,无法实现规模化生产应用。影响基因表达的因素有很多。如:基因拷贝数、密码子偏好性、启动子、终止子、反义RNA技术以及蛋白表达策略等。本研究试图从选择启动子、改变SD序列入手,对改进蓝藻外源基因表达系统和提高外源基因表达效率做一些探讨。集胞藻6803(Synechocystis sp. strain PCC6803)是一种单细胞蓝藻,具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等的特点,在特殊培养条件下还可以进行异养生长,非常适合于利用光合生物反应器大规模生产。因此,集胞藻6803是种很好的蓝藻基因工程受体。本研究选择集胞藻6803染色体DNA中cupA基因及其下游相连的两个片段分别作为上游整合平台(up)和下游整合平台(down),在二者间插入诱导型高效启动子、egfp(增强型绿色荧光蛋白基因)报告基因、卡那霉素抗性筛选标记,构建得到集胞藻6803同源重组双交换整合平台。在整合平台的基础上,通过更换启动子和进行SD序列距离修饰,共得到6个带启动子和1个不带启动子的转化载体。把转化载体分别自然转化到野生型集胞藻6803中,经卡那霉素筛选得到7个转基因藻。它们分别含有能够被红光诱导的Pcpcβ(转pK-Pcpcβ集胞藻6803和转pK-Pcpcβ2集胞藻6803)、被温度诱导的PgroESL(转pK-PgroESL集胞藻6803和转pK-PgroESL2集胞藻6803)、被光照诱导的PpsbA(转pK-PpsbA集胞藻6803和转pK-PpsbA2集胞藻6803)和1个不带启动子的转pK-P0集胞藻6803。根据启动子的不同诱导特性,分别设计梯度诱导条件诱导EGFP表达,通过检测EGFP(增强型绿色荧光蛋白)荧光检测分析。EGFP在488nm光激发下会辐射绿色荧光,利用激光共聚焦显微镜对藻细胞直接进行荧光活性检测。通过比较EGFP的检测结果,判断各转基因藻外源基因表达系统的表达效率。本实验主要结果或结论:1.构建得到6个带启动子的转化载体;2.构建得到1个不带启动子的转化载体;3.通过自然转化获得了7个转基因藻株;4. PgroESL具有温度诱导增强表达作用;5. SD序列修饰具有上调表达作用。

关键词：蓝藻基因工程同源重组转基因蓝藻表达调控集胞藻6803 绿色荧光蛋白 cpcβ启动子 groESL启动子 psbA启动子 SD序列

启动子对hGM-CSF基因在鱼腥藻7120中表达影响的研究

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启动子对hGM-CSF基因在鱼腥藻7120中表达影响的研究

作者：谭玮上海师范大学

学位级别：硕士

蓝藻是一种可以进行放氧光合作用的原核生物。它具有结构简单、培养成本低、绝大多数不含毒素、营养丰富、分布广泛、环境适应能力强、便于外源基因转化、蛋白酶活性低等优点。这些优点使蓝藻有可能成为较大肠杆菌和酵母更为理想的基因... 详细信息

蓝藻是一种可以进行放氧光合作用的原核生物。它具有结构简单、培养成本低、绝大多数不含毒素、营养丰富、分布广泛、环境适应能力强、便于外源基因转化、蛋白酶活性低等优点。这些优点使蓝藻有可能成为较大肠杆菌和酵母更为理想的基因工程宿主。随着蓝藻基因工程的发展,已有一批有应用前景的外源基因得到成功表达,使转基因蓝藻可以在医药和环保问题上得到应用。而人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一个被克隆和利用重组DNA技术生产的造血刺激因子,是一个具有多项潜能的造血生长因子,具有十分重要的临床应用价值,在国际生物技术制药市场上占有重要的位置。但是天然hGM-CSF因制备量少,纯度不够高等原因,远不能满足市场需要。因此,用基因工程来生产hGM-CSF有其重要的经济、社会意义以及独特的优越性。外源基因在蓝藻细胞中表达效率较低一直以来都是制约蓝藻基因工程长足发展的一个瓶颈。而影响蓝藻外源基因表达调控的关键就是转录和翻译水平上的调控,对基因转录效率起决定作用的是由RNA聚合酶与启动子之间相互作用所控制的起始过程,所以启动子的选择对外源基因的表达至关重要。因此,本研究根据鱼腥藻7120中RNA聚合酶的特性以及蓝藻内源启动子的结构性质,选用了两个蓝藻内源启动子Pcpcβ和PgroESL来起始转录表达外源基因hGM-CSF。运用PCR方法,从蓝藻中成功调出藻蓝蛋白β亚基基因启动子Pcpcβ和热休克基因启动子PgroESL,将外源基因插入到启动子的下游后进一步与穿梭表达载体pDC-08相连构建成两个穿梭表达载体pDC-C-GM和pDC-G-GM。利用三亲接合转移法转化到鱼腥藻7120中,通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到能稳定遗传的含有目的基因和目的启动子的两个转基因藻cGM和gGM,并对转基因藻的最适生长条件进行了优化筛选。测定了转基因藻的生理活性、PCR及Western blotting的数据分析,以此来探测外源基因hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达效率。本论文的主要内容及结果如下: 1.从聚球藻7002总DNA中克隆出了Pcpcβ启动子,然后从实验室中已构建好的pDC–GM载体中将被修饰的外源基因hGM-CSF经双酶切切下,将其插入到载体pUC-cpcβ的启动子Pcpcβ下游,最后将其连同启动子一起克隆到穿梭载体的pDC-08的相应位点,成功的构建了穿梭表达载体pDC-C-GM,并通过三亲接合转移方法转入鱼腥藻7120中,通过抗生素筛选及继代培养后,获得了转基因藻cGM。 2.从聚球藻7942总DNA中克隆出了热休克启动子PgroESL,然后从实验室中已构建好的pDC–GM载体中将经修饰的外源基因hGM-CSF经双酶切切下,将其插入到载体pUC-groESL的启动子PgroESL下游,最后将其连同启动子一起克隆到穿梭载体的pDC-08的相应位点,成功的构建了穿梭表达载体pDC-G-GM,并通过三亲接合转移方法转入鱼腥藻7120中,通过抗生素筛选及继代培养后,获得了转基因藻gGM。 3.对两种转基因藻进行了DNA水平检测,通过PCR方法,测定了转基因藻cGM基因组DNA中已稳定存在启动子Pcpcβ和外源基因hGM-CSF;转基因藻gGM基因组DNA中已稳定存在启动子PgroESL和外源基因hGM-CSF。 4.对两种转基因藻进行了优化培养,在本实验设置的范围内,两种转基因藻cGM和gGM的适宜温度为30℃,适宜pH值为9.5,适宜光照强度为60--90μmol m-2·s-1 5.对两种转基因藻进行了Western blotting检测,表明在两种转基因藻中均表达了具有免疫活性的hGM-CSF。利用软件分析结果,证实Pcpcβ启动下的hGM-CSF比启动子PpsbA下的hGM-CSF表达量提高90%;证实PgroESL启动下的hGM-CSF经过高温热诱导后比PpsbA下的hGM-CSF表达量提高459%. 以上结果证明,替换了启动子的目的基因hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达效率在一定程度上有了明显提高,尤其是热休克启动子PgroESL启动下的hGM-CSF经过热诱导后,表达量较PpsbA下的hGM-CSF提高了459%.为将来进一步利用蓝藻制备hGM-CSF基因药物的口服剂和研究如何提高外源基因在蓝藻中的表达作一些基础工作。

关键词：蓝藻基因工程人粒-巨噬细胞集落刺激因子鱼腥藻7120 启动子三亲接合转移转基因蓝藻

T7RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中的构建及GCSF的表达

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T7RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中的构建及GCSF的表达

作者：田钰琪北京中医药大学

学位级别：硕士

蓝藻是一种光合自养的原核生物,由于其代谢的结构的特点,在成为工业化的底盘细胞应用上有客观的前景。蓝藻的培养具有成本低廉,操作简便,对人体无毒害性等特点。蓝藻作为生物工程的底盘细胞最大的限制仍然在于外源基因的表达量相对不高... 详细信息

蓝藻是一种光合自养的原核生物,由于其代谢的结构的特点,在成为工业化的底盘细胞应用上有客观的前景。蓝藻的培养具有成本低廉,操作简便,对人体无毒害性等特点。蓝藻作为生物工程的底盘细胞最大的限制仍然在于外源基因的表达量相对不高。T7RNA聚合酶表达体系是来源于大肠杆菌T7噬菌体的一个高效原核表达体系,最高可达总蛋白45%的外源蛋白表达量。如今源于T7RNA聚合酶表达系统的pET载体成功商业化。T7RNA聚合酶表达系统的真核应用亦有研究,并已经成功构建了有此表达体系的多种真核表达细胞系,但由于真核原核的差异性,目前未能有真核T7聚合酶表达系统投入生产。本研究致力于在原核表达底盘细胞—蓝藻中引入完整的T7RNA聚合酶表达系统,通过转入的T7RNA聚合酶基因表达,识别转入质粒上的T7启动子的,获得外源GCSF的表达。目的:分子生物学方法验证含T7RNA聚合酶的转基因蓝藻,设计及构建表达GCSF基因的穿梭表达载体,并通过三亲接合转移将其转化到含T7RNA聚合酶的蓝藻中,通过抗生素抗性筛选、分子生物学鉴定获得可以通过T7RNA聚合酶系统表达人粒细胞集落刺激因子的蓝藻,以验证此系统的可行性。方法:PCR、RT-PCR、Western Blotting验证本实验待使用的转T7RNA聚合酶基因蓝藻;设计、合成目标序列,并酶切连接获得表达载体;三亲接合转移获得含有目标表达系统的蓝藻,抗性筛选,PCR、RT-PCR、Western Blotting验证目标基因表达,并比较、观察蓝藻细胞生长状态。结果:1、通过PCR,RT-PCR,Western Blotting的方法对转入T7RNA聚合酶的蓝藻进行验证,实验结果表明T7RNA聚合酶基因成功转入鱼腥藻7120,得到明显PCR及RT-PCR结果,Western Blotting结果显示转入基因造成蓝藻蛋白表达情况与野生型有较大差异;2、设计并构建穿梭表达载体;在本实验室留存的GCSF基因5'端引入T7启动子,在3'端加上组氨酸标签以便检测,两端加上酶切位点方便操作。通过双酶切去掉载体pRL-489原有启动子,并于构建的目标基因片段连接,使构建的穿梭表达载体中仅有T7启动子一种启动子存在。构建成功载体转入自制的感受态HB101菌株。筛选后通过PCR、酶切方法验证目标基因。3、穿梭表达载体构建成功后,通过三亲接合法转化蓝藻。设置不同对照组,考察转入有T7RNA聚合酶基因的蓝藻及转入野生型蓝藻,以及转入有T7启动子的载体和使用原有载体后的生长情况。4、转化后相应抗性筛选,并用PCR验证目标基因的转入。观察到转化后的蓝藻出现了变色生长的现象。经过对生长发红的转化子的观察,发现其为单细胞。5、PCR验证为阳性的蓝藻进行生长、诱导生长情况对比,使用IPTG浓度为1mmol诱导,考察一周内蓝藻生长变化,发现IPTG会抑制蓝藻生长,加入后生长量明显较未加较少。另外加入IPTG两周后,蓝藻细胞会破裂,细胞内物质会有所释放。6、后进行半定量RT-PCR及WB,发现含有T7RNA聚合酶蓝藻转入含T7启动子GCSF基因后外源蛋白有表达,进行灰度值分析,发现比使用PpsbA启动子的表达载体表达效率有提高。结论:验证表明T7RNA聚合酶基因成功转入鱼腥藻7120中,可以以此作为后续实验材料。获得了有T7启动子的pRL-T7-GCSF穿梭表达载体,转化后获得了 GCSF基因的表达。

关键词：鱼腥藻PCC7120 T7RNA聚合酶/T7启动子表达系统三亲接合转移穿梭表达载体 GCSF 蓝藻基因工程