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蓝舌病病毒4型VP5蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

蓝舌病病毒4型VP5蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

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作者：孙亮中国农业科学院

学位级别：硕士

蓝舌病(Bluetongue, BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的,主要感染绵羊,山羊,牛和鹿等反刍动物的非接触性传染病。该病经媒介昆虫(库蠓,伊蚊等)传播,可以引起病畜高热,过度流涎,面部和舌头肿胀以及... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue, BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的,主要感染绵羊,山羊,牛和鹿等反刍动物的非接触性传染病。该病经媒介昆虫(库蠓,伊蚊等)传播,可以引起病畜高热,过度流涎,面部和舌头肿胀以及舌头发绀等。到目前为止,世界上已经发现26种BTV血清型。由于抗原变异以及各个血清型之间有限的免疫交叉保护力,这给BTV的免疫预防带来了极大地困难。因此,群特异性或型特异性表位疫苗的发展对BTV的防治具有重要的意义。本研究首先对GenBank中各个地理分离株BTV4的S6序列进行比对,根据非编码区的保守性序列设计反转录引物。然后从BTV4感染的BHK-21细胞中提取基因组dsRNA,对VP5蛋白的目的基因进行RT-PCR,连接至pEASY-Blunt载体,并对其测序。根据测序结果,分别设计上下游引物,对VP5目的基因的编码区进行PCR,经双酶切后连接至原核表达载体pMALTM-c4x和Bac-to-Bac真核表达载体pFastBacTMHTA,构建重组质粒pMAL-VP5和pFast-VP5.将重组质粒pFast-VP5转化至DH10Bac感受态细胞进行基因重组,提取重组杆粒BAC-VP5。然后将重组杆粒转染至Sf21昆虫细胞,拯救出能够稳定表达VP5蛋白的重组杆状病毒BACV-VP5。由于全长VP5蛋白表达量很低,所以把N端缺失41氨基酸的VP5蛋白按照上述过程分别进行原核和真核表达。用原核表达并纯化的VP5蛋白作为免疫原对4-6周龄的BALB/c小鼠进行免疫,经过三次免疫,测其抗体效价,然后在融合前三天加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用杆状病毒BACV-VP5在Sf21细胞中表达的重组VP5蛋白作为检测抗原包被ELISA板,筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次细胞克隆纯化,筛出5株能够稳定分泌针对VP5蛋白的MAbs,分别是1D3,2C3,4C11,186和3E4。Western blot鉴定表明,5株MAbs均可与BTV4感染的BHK-21细胞的VP5蛋白反应,而与阴性对照BHK-21细胞不反应;IFA鉴定表明,5株MAbs均能与BTV4感染的细胞发生特异性免疫荧光反应,与其他血清型的BTV,中山病毒(Chuzan virus)感染细胞的反应谱系不一,而与赤羽病病毒(Akabane virus)和BHK-21细胞呈阴性反应。所制备的5株MAbs共鉴定出5个不同的B细胞线性表位(E1-119-134aa, E2-257-272aa, E3-286-301aa, E4-322-337aa和E5-481-496aa),同时利用软件对鉴定的表位进行保守性分析,结果发明,来自不同地理分布的BTV4病毒株的VP5蛋白序列之间高度保守;对BTV1-26以及同一种属其它病毒VP5蛋白序列比对显示,表位257KLKKVINALSGIDLSH272和481VYDEELQMHILRGPLH496相对比较保守,而表位119ITKEFGKELEEVYDFM134,286TLEHRFKEIPDEQLAV301和322QEILPKFKQMDEEKE337保守性较差。本实验共制备5株抗BTV4VP5蛋白的MAbs,并鉴定获得5个抗原表位,这些都为VP5蛋白结构与功能的研究以及表位疫苗与标记疫苗的研制奠定了基础,同时对BTV的鉴别诊断也具有重要意义。

关键词：蓝舌病病毒4型 VP5蛋白单克隆抗体抗原表位

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