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链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

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微生物学报 2018年第10期58卷 1839-1852页

作者：郑芳芳王金佩林宇王子龙韦宇拓黄日波杜丽琴广西大学生命科学与技术学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530005

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测... 详细信息

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。

关键词：链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶酶学性质酶分子改造葡萄糖耐受性

来源于Alicyclobacillus sp.A4的GH1家族β-葡萄糖苷酶的克隆表达及葡萄糖耐受性分子改造

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来源于Alicyclobacillus sp.A4的GH1家族β-葡萄糖苷酶的克隆表达...

作者：曹慧方中国农业科学院

学位级别：硕士

β-葡萄糖苷酶在饲料工业、食品工业、生物合成以及生物燃料等领域具有重要的应用价值。尤其在目前以玉米豆粕型日粮为主的饲料领域,β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元,从而发挥其促进动物生长及加速蛋白合成等... 详细信息

β-葡萄糖苷酶在饲料工业、食品工业、生物合成以及生物燃料等领域具有重要的应用价值。尤其在目前以玉米豆粕型日粮为主的饲料领域,β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元,从而发挥其促进动物生长及加速蛋白合成等功效,但β-葡萄糖苷酶的转化过程受肠道中较高浓度葡萄糖的抑制作用。研究表明,和GH3家族相比,GH1家族β-葡萄糖苷酶不仅具有较高的葡萄糖耐受性,而且一定浓度范围内的葡萄糖对其具有酶活促进效应,可以有效促进动物肠道中大豆异黄酮的水解,所以提高饲料利用率上GH1家族β-葡萄糖苷酶具有巨大应用潜力。本研究从嗜酸耐热菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆得到一个GH1家族β-葡萄糖苷酶基因Asbg1,并在大肠杆菌表达宿主中进行了高效异源表达和镍离子纯化。性质测定表明:AsBG1是一个典型的中温偏酸性β-葡萄糖苷酶,其最适pH为6.5,在pH 5.5-7.0具有80%以上的酶活,在pH 5.0-10.0具有良好的pH稳定性。最适温度为55°C,在50°C热稳定性良好。AsBG1具有宽泛的底物特异性,对芳香类(p NPG、大豆苷),寡糖类(纤维寡糖、昆布寡糖)和多糖类底物(大麦葡聚糖、地衣多糖等)底物具有活性。动力学参数测定表明,AsBG1对pNPG和纤维二糖的K分别为0.4和7.3 mM,k/K分别为215和9 s·mM。对AsBG1的耐受性进行了系统的测定:以2 mM pNPG为底物时,AsBG1对多种单糖(葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖)都具有较强的耐受性,其对葡萄糖的半抑制浓度IC为800 mM,0-200 mM葡萄糖对其酶活具有显著促进作用(最高120%),但10 mM的pNP则抑制其40%的酶活;以2 mM纤维二糖为底物时,10 mM的葡萄糖和pNP分别抑制其60%和70%的酶活。初步表明AsBG1的高葡萄糖耐受性只针对疏水性底物。为了进一步提高AsBG1的葡萄糖耐受性,本研究通过同源建模、序列比对、分子对接技术等生物信息学手段,聚焦于催化通道内葡萄糖的非活性结合位点,进行了AsBG1的单点突变分子改造。对不同突变体的关键性质测定表明:100 mM葡萄糖对WT、H315R和M325K酶活促进作用分别为125%、163%、162%;以1 mM大豆苷为底物,10 mM的葡萄糖对WT、H315R和M325K分别具有163%、212%和226%的促进作用,因此可以更有效地促进单胃动物肠道内大豆异黄酮的水解效率,同时对该家族相关耐受性机制的研究具有重要的指导意义。

关键词： GH1家族糖苷水解酶 β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性分子改造大豆异黄酮

葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶Bg16的宏基因组筛选、分子改造及其耐受葡萄糖机制的初步研究

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葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶Bg16的宏基因组筛选、分子改造及其耐...

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：曹立创黄欣孔伟覃宗敏王志军任广辉刘玉焕中山大学生命科学学院

β-葡萄糖苷酶常受其降解产物的反馈抑制,使其成为纤维素降解的限速酶,具有葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶可明显提高纤维素转化率。同时,纤维素的高效酶解还要求β-葡萄糖苷酶具有较高的活性和良好的热稳定性。目前己报道的β-葡萄糖苷... 详细信息

β-葡萄糖苷酶常受其降解产物的反馈抑制,使其成为纤维素降解的限速酶,具有葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶可明显提高纤维素转化率。同时,纤维素的高效酶解还要求β-葡萄糖苷酶具有较高的活性和良好的热稳定性。目前己报道的β-葡萄糖苷酶尚不能满足工业应用要求,因此,寻找或通过分子改造获得同时具有上述特性的β-葡萄糖苷酶成为一项重要的课题。通过宏基因组技术,我们筛选到一个β-葡萄糖苷酶Bgl6(Genbank登录号:KP736171),该酶属于糖苷水解酶1家族。酶学性质研究表明,其最适温度和pH分别为50℃和6.0;在50℃时半衰期为1h;K/K为0.56 mMs;半数抑制浓度(IC)为3.5 M,在葡萄糖浓度为0.5M时,其活性是原来的4.5倍。为了提高Bgl6的热稳定性,使用易错PCR和有益突变叠加,获得突变体M3(V174C/A404V/L441F)。M3在50℃时的半衰期是Bgl6的48倍(48vs 1h),T值比Bgl6高7.6℃(60.7vs 53.1℃),K/K值是Bgl6的3倍(1.69vs0.56 mMs),IC值为3.0M,葡萄糖激活倍数为2.1。以10%(w/v)的SCB为底物,在Celluclast1.5L中添加M3,纤维素的转化率从64%提高至94%。这些结果表明,与Bgl6相比,M3对纤维素的水解能力明显提高。为了进一步评估M3在高固体含量纤维素水解中的应用潜力,在SCB水解体系中加入起始浓度为20-500 mM的葡萄糖,与单独使用Celluclast 1.5L相比,添加M3使纤维素的转化率提高14-35%。这说明,在高浓度葡萄糖存在的条件,M3仍能较好的发挥作用。进一步对174、404和441位点进行饱和突变,综合考虑突变体的蛋白表达量、热稳定性、纤维二糖活性和葡萄糖耐受性,通过有益突变叠加获得突变体M3N5。同时,我们解析了Bgl6和M3的晶体结构(PDB登录号为5GNX,5GNY和5GNZ),通过理性设计突变G178Q、L185H和L415N来提高该酶的活性。在M3N5的基础上,叠加G178Q和L185H,构建突变体M4(M3N5-G178Q)和M5(M3N5-G178Q/L185H)。M4和M5在50℃时的半衰期分别为60和96 h,是Bgl6的60和96倍;T值分别为61.2和65.1℃,比Bgl6高8.1和12℃;K/K值分别为3.54和3.59 mMs-10,约为Bgl6的6.5倍。M4的IC值约为3.5M,葡萄糖激活倍数为1.9;M5的IC值为0.4 M,无葡萄糖激活作用。目前,对葡萄糖激活作用有三种解释:蛋白质变构效应、转糖基化反应和底物抑制缓解。选择具有激活作用、但激活倍数不同的Bgl6及突变体V174C、L185H、A404V和L441F,对其耐受葡萄糖的机制进行初步研究。结果显示,Bgl6、V174C、A404V和L441F的葡萄糖激活作用可能是底物抑制缓解引起的,而L185H的葡萄糖激活作用可能和转糖基或者蛋白质变构效应相关。这是首次发现单个氨基酸替换能引起β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性机制发生转换。这些突变体为进一步研究葡萄糖耐受性的分子机制提供了良好材料。

关键词：纤维素酶 β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性定向进化理性设计

来源： cnki会议评论

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菌物研究 2018年第1期16卷 36-42页

作者：刘玉姣高金鹏刘娇娇李多川山东农业大学植物保护学院菌物学系泰安271018

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335... 详细信息

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。

关键词： β-葡萄糖苷酶定点突变进口端葡萄糖耐受性

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胎儿期营养不良对成年后葡萄糖耐受性的影响

中国社会医学杂志 1999年第1期16卷 47-48页

作者：郄文娟米文育

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出生前营养不良对成年后葡萄糖耐受性的影响

解放军医药杂志 1999年第2期21卷 161-161页

作者：郄文娟米文育石家庄医高专

子宫内增长缓慢与成年后2型(非胰岛素依赖型)糖尿病的发病及对葡萄糖的耐受性降低有关。但人类还没有直接证据表明妊娠期间母体的营养影响到子代的胰岛素-葡萄糖代谢。

关键词：葡萄糖耐受性营养不良成年后暴露人群出生前葡萄糖代谢血糖浓度出生人群非胰岛素胰岛素浓度

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妊娠期葡萄糖耐受性差可增加远期癌症的风险

国外医学情报 2004年第7期25卷 40-40页

作者：梁星

最新研究结果表明,妊娠期葡萄糖耐受性差的妇女其与剂量相关的远期癌症风险将有所增加,特别是乳腺癌风险的增加。来自于新西兰克赖斯特彻奇 Otago 大学的Shelagh I.Dawson 教授强调指出,此前的报道认为糖尿病与癌症密切相关。然而,人们... 详细信息

最新研究结果表明,妊娠期葡萄糖耐受性差的妇女其与剂量相关的远期癌症风险将有所增加,特别是乳腺癌风险的增加。来自于新西兰克赖斯特彻奇 Otago 大学的Shelagh I.Dawson 教授强调指出,此前的报道认为糖尿病与癌症密切相关。然而,人们尚不清楚某种轻微的疾病形式(如妊娠期对葡萄糖的耐受性差)

关键词：妊娠期葡萄糖耐受性远期癌症发病原因

用新式采样管通过人体75克口腔葡萄糖耐受性试验成功地对血糖进行监测

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国际生物医学工程杂志 1992年第1期 51-51页

作者：张永红

一种新颖的非侵入准连续通过人体75克口腔葡萄糖耐受性试验(oral glucose tolerance test-OGTT)跨皮肤的血糖监测方法已经形成。在皮肤表面用抽引器得到渗漏液并标明渗漏液(suction effusion fluid-SEF)。本系统由两个主要部分组成:一... 详细信息

一种新颖的非侵入准连续通过人体75克口腔葡萄糖耐受性试验(oral glucose tolerance test-OGTT)跨皮肤的血糖监测方法已经形成。在皮肤表面用抽引器得到渗漏液并标明渗漏液(suction effusion fluid-SEF)。本系统由两个主要部分组成:一个抽引装置和一个葡萄糖传感器系统。抽引装置运用真空器在绝对压力为400mmHg下在病人皮肤表面收集SEF。基于葡萄糖传感器的离子敏感场效应管(ionsensitive field effect transistor-ISFET)的微小模型能测量极少量SEF中的葡萄糖含量。该监测系统根据在SEF中和

关键词：葡萄糖耐受性 OGTT 口腔

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β-葡萄糖苷酶的耐受性分析及分子改造

β-葡萄糖苷酶的耐受性分析及分子改造

作者：胡小妍天津科技大学

学位级别：硕士

β-葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有活性,可作用于多种生物活性物质,其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分;有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性,可转化生成功能性低聚糖,因此在食品保健,生物能源等领域具有广阔的应用前景。但... 详细信息

β-葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有活性,可作用于多种生物活性物质,其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分;有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性,可转化生成功能性低聚糖,因此在食品保健,生物能源等领域具有广阔的应用前景。但由于实际生产过程中多数酶的产物耐受浓度低,酸碱或温度耐受能力差,极大地限制了其应用。本研究旨在筛选开发新型β-葡萄糖苷酶,结合分子动力学模拟对酶进行定向改造,提高其应用性能,进一步丰富β-葡萄糖苷酶酶系,为酶在不同应用领域的应用开发奠定了基础。利用毕赤酵母表达系统成功表达了来源于特异腐质霉和棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶,BglHi和BglAa,对其温度、pH和金属离子稳定性及葡萄糖耐受性等酶学性质进行分析。通过酶学性质的比较,发现特异腐质霉来源的β-葡萄糖苷酶BglHi具有良好的葡萄糖耐受性,当葡萄糖浓度为1 mol/L时仍能对酶的活力起促进作用;棘孢曲霉来源的β-葡萄糖苷酶BglAa在不同pH下的稳定性较BglHi的差异性更大。故以BglHi和BglAa为研究对象进行葡萄糖和pH耐受性的分析。结合分子动力学模拟,利用定点突变技术对BglHi进行分子改造,获得了 40株突变体,其中突变体A356P的酶活力及耐受能力均有提高,酶活力提高了 40.28%,400 mmol/L葡萄糖对其活力的促进作用为182.88%;突变体T333Q和T333K的耐受性提高,400 mmol/L葡萄糖对其促进作用分别为248.59%和260.78%;突变体F327Y和R280H的酶活力分别提高了 33.13%和31.52%。对变化原因进行分析发现突变位点氨基酸的变化使其与葡萄糖的结合能力更强,同时对蛋白的稳定性进行分析发现突变体的稳定性更好更易于行使催化能力,该数据对葡萄糖耐受机制的研究奠定了基础。在对不同底物转化能力的分析中发现BglHi可水解多数糖苷类化合物,如纤维二糖、虎杖苷和罗汉果苷等,并且葡萄糖存在时提高了对虎杖苷的水解能力,为酶法转化虎杖苷提供了生物材料,同时该酶还具有转糖苷能力,可转化葡萄糖和纤维二糖生成龙胆二糖和纤维三糖,拓宽了该酶的应用领域。对不同来源β-葡萄糖苷酶pH稳定性的分析中发现在酸性环境下其稳定性差异较大,结合分子动力学模拟分析得到在pH 2.0时酶蛋白BglAa结构的整体紧凑性下降,活性中心空间距离由8.33 （?）增大到15.24 A,使得活力降低,这些实验数据有利于酸耐受性新酶的合理开发。

关键词： β-葡萄糖苷酶克隆表达分子改造葡萄糖耐受性 pH耐受性