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纳米花固定化葡萄糖异构酶的制备及性能分析

现代食品科技 2023年第11期39卷 78-85页

作者：王世杰崔诗琦姜晓冬王红英钱斯日古楞大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

该研究采用共沉淀法制备了葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase,GI)纳米花,对固定化条件进行了优化,同时对纳米花固定化酶的形态特征以及酶学性质进行了探究。结果表明,40μL酶液中加入9 mL、pH值7.4的PBS缓冲液后与30μL CuSO_(4)混合,在3... 详细信息

该研究采用共沉淀法制备了葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase,GI)纳米花,对固定化条件进行了优化,同时对纳米花固定化酶的形态特征以及酶学性质进行了探究。结果表明,40μL酶液中加入9 mL、pH值7.4的PBS缓冲液后与30μL CuSO_(4)混合,在35℃条件下静置反应18 h,制得的纳米花固定化葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase@Nano flowers,GI@NFs)的酶活回收率高达183.06%。SEM表征结果显示GI@NFs有完整的纳米花结构,傅里叶红外光谱显示GI@NFs具有酶和PO_(4)^(3-)的特征吸收,X-射线衍射结果进一步证明其载体为Cu_(3)(PO_(4))_(2)。酶学性质研究发现,GI@NFs的最适反应温度为60℃,比自由酶的提高了10℃;最适反应pH值为8,比游离酶的最适pH更高;GI@NFs的温度稳定性和pH稳定性均比自由酶的明显提高;固定化酶被循环使用8次,其酶活力仍保持最初活力的60.32%。实验结果表明,纳米花结构提高了葡萄糖异构酶的酶活,表现出较好的循环性能和稳定性,具有一定的应用价值。

关键词：固定化酶纳米花葡萄糖异构酶酶活力

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葡萄糖异构酶的固定化及其性质研究

高等学校化学学报 1996年第5期17卷 735-738页

作者：葛玉斌王立平孔维周慧李惟沈家骢吉林大学分子生物学系

用分子沉积法，在多孔三甲胺基聚苯乙烯载体上成功地固定化了双层葡萄糖异构酶。结果表明，这种新固定化酶方法能使单位重量的固定化酶活力及蛋白载量成倍增加，活力达到１２００ＩＵ／ｇ湿胶。与吸附法相比，酶活力提高１倍；其半衰期... 详细信息

用分子沉积法，在多孔三甲胺基聚苯乙烯载体上成功地固定化了双层葡萄糖异构酶。结果表明，这种新固定化酶方法能使单位重量的固定化酶活力及蛋白载量成倍增加，活力达到１２００ＩＵ／ｇ湿胶。与吸附法相比，酶活力提高１倍；其半衰期与吸附法相比则基本相同，为４５ｄ．还确定了最佳固定化条件并测定了固定化酶的性质。固定化酶的最适反应温度比液相酶提高１５℃，而最适ｐＨ值则没有改变。Ｋ＿ｍ值与液相酶的相比有一定程度的增加，稳定性与吸附法相比则基本相同。

关键词：葡萄糖异构酶固定化分子沉积

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葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

生物化学与生物物理进展 2000年第2期27卷 127-131页

作者：朱国萍程阳宫春红徐冲中国科学技术大学生命科学学院合肥230026

D 葡萄糖异构酶 (GI)能分别催化D 葡萄糖和D 木糖异构为D 果糖和D 木酮糖 .它是工业上生产高果糖浆的关键酶 .在GI负氢离子转移机制中 ,其主要特征是底物的开环、通过C2 至C1间负氢离子转移的GI异构化作用、以及产物的闭环 .GI基因已在... 详细信息

D 葡萄糖异构酶 (GI)能分别催化D 葡萄糖和D 木糖异构为D 果糖和D 木酮糖 .它是工业上生产高果糖浆的关键酶 .在GI负氢离子转移机制中 ,其主要特征是底物的开环、通过C2 至C1间负氢离子转移的GI异构化作用、以及产物的闭环 .GI基因已在同源、异源宿主中获得克隆、测序和超量表达 .经过蛋白质工程改造的GI将是未来最重要的工业用酶之一 .

关键词：葡萄糖异构酶高果糖浆蛋白质工程空间结构

葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

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生物工程学报 2002年第3期18卷 304-307页

作者：朱国萍张颖徐旸唐建国徐冲中国科学技术大学生命科学学院分子生物学与细胞生物学系合肥230026

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ... 详细信息

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ,加入 2 μg mL硫链丝菌素诱导表达 12h。SDS PAGE电泳表明 ,两个穿梭载体在TK5 4菌株内表达出 42 5kD特异性条带。薄层扫描显示 ,突变体酶GIG138P和GIG138P G2 47D分别约占可溶性蛋白的19%和 2 2 %。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P G2 47D在变铅青链霉菌TK5

关键词：葡萄糖异构酶突变体酶穿梭载体变铅青链霉菌高效表达 GIG138P GIG138P-G247D

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嗜热葡萄糖异构酶的挖掘及定向进化研究

嗜热葡萄糖异构酶的挖掘及定向进化研究

作者：董瑜琪河南工业大学

学位级别：硕士

葡萄糖异构酶(glucose isomerase,简称GI,EC 5.***.1.5)是一种可以催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的一种异构酶。国内所生产的葡萄糖异构酶大多催化活力低且热稳定性差,所以生产高果糖浆、结晶果糖的公司长期依赖于进口国外企业生产的葡萄糖... 详细信息

葡萄糖异构酶(glucose isomerase,简称GI,EC 5.***.1.5)是一种可以催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的一种异构酶。国内所生产的葡萄糖异构酶大多催化活力低且热稳定性差,所以生产高果糖浆、结晶果糖的公司长期依赖于进口国外企业生产的葡萄糖异构酶,因此挖掘具有自主产权的葡萄糖异构酶具有重要的研究意义。本课题通过设计虚拟探针从Gene Bank数据库挖掘到来源于Caldicellu Losiruptor acetigenus(CAGI)、Thermoanaerobacter thermocopriae(TTGI)及Thermotoga petrophila(TPGI)的嗜热葡萄糖异构酶,并成功在大肠杆菌中进行异源表达,对纯化后的葡萄糖异构酶进行酶学性质表征;进一步对葡萄糖异构酶TTGI进行丙氨酸扫描,结合动力学模拟对其亚基结合位面研究;最后对葡萄糖异构酶TTGI进行固定化条件的优化。主要研究内容如下:(1)基于Fold X和Rosetta对葡萄糖异构酶进行全蛋白能量扫描,设计虚拟探针与保守序列相结合的方式从Gene Bank数据库中进行基因挖掘,成功筛选到CAGI、TTGI和TPGI。对葡萄糖异构酶进行分离纯化并进行酶学性质表征。其中TTGI最适p H为8.0,最适温度大于95℃,在90℃下半衰期大于24 h,是典型的嗜热酶。葡萄糖异构酶TTGI的酶促动力学参数为:Km为103.4 m M,vmax为72.8 U/mg,kcat为35.3 s,表明基于虚拟探针成功挖掘到嗜热的葡萄糖异构酶基因。(2)对葡萄糖异构酶TTGI的四级结构进行研究,对其亚基界面位点进行丙氨酸扫描,发现C端loop区域的柔性对葡萄糖异构酶催化活性具有较大影响,推测C端loop区域的柔性对葡萄糖异构酶形成二聚体存在影响;根据丙氨酸扫描结果对336位点进行饱和突变发现提升65℃转化率的突变体TTGI-N336T。对突变体进行酶学性质表征及动力学参数测定。TTGI-N336T 65℃转化率提升9.7%,最适p H为7.5-8.0。(3)运用包埋-交联与仿生矿化相结合的方法将葡萄糖异构酶TTGI的粗酶液固定在硅藻土中,最优固定化条件为:在25℃下,每1 m L含有0.5 mg/m L的粗酶液中加入50 mg硅藻土进行包埋,添加0.5%(v/v)的戊二醛水溶液交联30 min,漂洗3次后添加钛前体进行矿化,得到带有二氧化钛壳层的葡萄糖异构酶硅藻土,固定化酶的酶活力为106.4 U/g,使用固定化葡萄糖异构酶2 h内可获得55.1%的高果糖浆。

关键词：葡萄糖异构酶基因挖掘定向进化固定化

UCST型温敏聚合物设计合成及其对辣根过氧化物酶/葡萄糖异构酶固定化性能研究

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UCST型温敏聚合物设计合成及其对辣根过氧化物酶/葡萄糖异构酶固...

作者：宋永庆江苏大学

学位级别：硕士

固定化酶因其具有稳定性高、耐受性强以及可循环使用等优势,在酶催化应用领域具有广阔的应用前景。然而,目前大多数固定化酶载体为不溶性载体,制备的固定化酶在使用时难以实现均相催化,从而降低其催化效率。本课题设计合成了一种水溶性... 详细信息

固定化酶因其具有稳定性高、耐受性强以及可循环使用等优势,在酶催化应用领域具有广阔的应用前景。然而,目前大多数固定化酶载体为不溶性载体,制备的固定化酶在使用时难以实现均相催化,从而降低其催化效率。本课题设计合成了一种水溶性的UCST型温敏聚合物,并将其作为可溶性固定化酶载体材料,制备固定化辣根过氧化物酶(HRP)和固定化葡萄糖异构酶(GI)。具体研究内容如下:(1)采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)反应制备得到UCST型温敏聚合物m VBA-b-p(AAm-co-AN)。实验通过改变疏水性基团AN含量合成三种不同聚合度的m VBA-b-p(AAm-co-AN)。通过核磁氢谱(H NMR)、凝胶色谱(GPC)、动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)对合成的聚合物进行表征。实验研究了聚合物的温敏性能,实验结果表明,聚合物中AN含量越高,对应的聚合物UCST越高;聚合物浓度越高,其UCST就越高。进一步研究了三种不同浓度的电解质(硫酸钠、氯化钠、硫氰酸钠)对聚合物UCST的影响。结果显示氯化钠对UCST的影响最小,几乎没有变化;硫氰酸钠则会使UCST显著下降;硫酸钠会使UCST显著上升。同时,硫酸钠、氯化钠、硫氰酸钠对不同浓度的聚合物的UCST也具有相同的效果。(2)基于m VBA-b-p(AAm-co-AN)聚合物中苯基硼酸基团与酶分子中邻二羟基基团的亲和作用制备固定化酶。从三种不同聚合度的m VBA-b-p(AAm-co-AN)聚合物中筛选出P1为固定化酶载体材料,成功制备固定化酶P1-HRP。实验优化了固定化酶P1-HRP的固定化条件,最终在聚合物P1浓度为20 mg/m L,温度为50℃,p H=8.0,时间为2 h的条件下,得到最佳固载量(84.7 mg/g)。并通过激光共聚焦(CLSM)、扫描电镜(SEM)、动态光散射(DLS)、热重分析(TGA)等表征,证明固定化酶P1-HRP制备成功。固定化酶P1-HRP的p H和热稳定性均高于游离酶HRP,且固定化酶P1-HRP的贮藏稳定性也得到了较大提高,在低温(4℃)下保存5周后,固定化酶P1-HRP仍有45.76%的活性。重复利用性良好,重复降解苯酚10次后,相对酶活力保留55.62%。实验优化了固定化酶P1-HRP催化降解苯酚最佳条件:苯酚溶液浓度为100 mg/L,苯酚与HO摩尔比为1:1,固定化酶P1-HRP浓度为1 mg/m L,时间为60 min。在相同条件下催化降解苯酚60 min后,固定化酶P1-HRP的降解率(92.33%)高于游离酶HRP(85.32%)。(3)基于戊二醛的交联作用和苯基硼酸基团的亲和作用,以m VBA-b-p(AAm-co-AN)聚合物为有机载体制备固定化GI。从三种不同聚合度的m VBA-b-p(AAm-co-AN)聚合物中筛选出P1为固定化酶载体材料,成功制备固定化酶P1-GI。实验发现在戊二醛浓度为30 mg/m L,聚合物P1浓度为30 mg/m L,p H=8.0和时间为2 h条件下固定化酶,得到了最佳固载量为110.8 mg/g。实验通过激光共聚焦(CLSM)、扫描电镜(SEM)、动态光散射(DLS)、热重分析(TGA)等表征,证明固定化酶P1-GI制备成功。固定化酶P1-GI的酶学性质研究发现P1-GI的p H和热稳定性均高于游离酶GI,且固定化酶P1-GI贮藏稳定性也得到了较大提高,在低温(4℃)下保存5周后,固定化酶P1-GI仍有47.68%的活性。同时,重复利用性良好,重复催化果糖10次后,相对酶活力保留57.47%。实验优化了固定化酶P1-GI催化葡萄糖生产果糖最佳条件:金属离子(10 m M Co,10 m M Mg),p H=7.0,温度为85℃,时间为3 h。进一步讨论了固定化酶P1-GI的应用性研究,在相同条件下催化葡萄糖3 h后,固定化酶P1-GI的果糖产率(61.62%)要高于游离酶GI(54.21%)。

关键词：固定化酶 UCST型温敏聚合物控温沉淀辣根过氧化物酶葡萄糖异构酶

K253R和N184V点突变对葡萄糖异构酶热稳定性的影响

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生物化学与生物物理学报 1996年第3期28卷 272-278页

作者：伍传金肖亚中龙凡滕脉坤王淳崔涛中国科学技术大学生物系安徽大学生物系

用人工合成的寡核苷酸突变引物，以双引物法于重组Ｍ１３ｍｐ１９载体上进行定点突变，分别得到了葡萄糖异构酶的突变体ＧＩＫ２５３Ｒ和ＧＩＮ１８４Ｖ。测定它们的热稳定性，并将之与野生型酶比较，结果表明：（１）ＧＩＫ２５３Ｒ于... 详细信息

用人工合成的寡核苷酸突变引物，以双引物法于重组Ｍ１３ｍｐ１９载体上进行定点突变，分别得到了葡萄糖异构酶的突变体ＧＩＫ２５３Ｒ和ＧＩＮ１８４Ｖ。测定它们的热稳定性，并将之与野生型酶比较，结果表明：（１）ＧＩＫ２５３Ｒ于７０℃、８０℃下的热稳定性小于野生型，但在７０℃、１ｍｏｌ／ＬＬ－鼠李糖中，两者的失活速度相近。另外；ＧＩＫ２５３Ｒ的比活是野生型的１．５倍。（２）ＧＩＮ１８４Ｖ的比活和热稳定性都远低于野生型，Ａｓｎ１８４为酶活性中心构象的维持所必需．本文还根据动力学数据和分子结构模型对以上结果作了初步分析．

关键词：葡萄糖异构酶定点诱变蛋白质工程热稳定性

葡萄糖异构酶的结构特征及其工业(高产)用酶发掘

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第5期32卷 510-517页

作者：邓辉陈存武韦传宝皖西学院生物与制药工程学院安徽六安237012 六安市蛋白质分离与纯化研究中心安徽六安237012

葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GIase;EC 5.***.1.18)是利用淀粉生产果葡糖浆的关键用酶。筛选和构建适合大规模工业生产的GIase一直是研究的热点。本文首先综述葡萄异构酶的基本性质与序列结构和功能特性,在分析比对高生产性能GIase的... 详细信息

葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GIase;EC 5.***.1.18)是利用淀粉生产果葡糖浆的关键用酶。筛选和构建适合大规模工业生产的GIase一直是研究的热点。本文首先综述葡萄异构酶的基本性质与序列结构和功能特性,在分析比对高生产性能GIase的序列特征和空间结构特征的基础上,发现位于该组GIase的"催化口袋"上存在12个特有保守氨基酸残基位点,且有5个位点的残基含两性(亲水和疏水)的环状结构。由此提出了"高性能葡萄异构酶存在特有保守位点"的推断假设,并在结合自身实验结果和他人的研究,对基于特有保守位点发掘高生产性能GIase的可行性进行了进一步验证和探讨。该研究思路对高性能商业化GIase的发掘及对其它GIase的性能改造具有重要的参考价值。

关键词：葡萄糖异构酶结构特征发掘高生产性能

葡萄糖异构酶产生菌筛选培养基和测定方法的比较试验

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微生物学通报 1993年第3期20卷 187-189页

作者：王媺芝中国科学院微生物研究所北京100080

在本实验室条件下,经试验证明:2%玉米浆,1%玉米粉,0.1%K2HPO_4,0.1%。MgSO_4.7H_20是筛选产葡萄糖异构酶(EC 5,3,1.5)放线菌较适宜的培养基。酶反应时使用顾丁烯二酸钠缓冲溶液较好。显色法是测定葡萄糖异构酶比较简便准确的方法。

关键词：葡萄糖异构酶显色法咔唑法