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β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

华南理工大学学报（自然科学版） 2008年第12期36卷 112-115,145页

作者：郭成栓崔堂兵郭勇华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)... 详细信息

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明:该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近.

关键词：葡聚糖内切酶大肠杆菌短小芽孢杆菌基因克隆表达

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枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶的克隆与表征

华东理工大学学报（自然科学版） 2011年第3期37卷 265-267页

作者：邱立欢李春秀许建和华东理工大学生物反应器国家重点实验室上海200237

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillussp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG。经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最适反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性... 详细信息

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillussp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG。经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最适反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性,50℃时半衰期达101h。Km值为20.1 g/L,相应的Vmax值为0.075 g/(L·min)。并且初步对酶BsEG的底物特异性及对纤维素的吸附性进行了探究。

关键词：枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶酶学性质克隆表征

绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达

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食品与发酵工业 2012年第6期38卷 48-52页

作者：陈红漫张欣李艳秋阚国仕任大明沈阳农业大学生物科学技术学院辽宁沈阳110866

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目... 详细信息

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。

关键词：绿色木霉纤维素酶酿酒酵母葡聚糖内切酶克隆表达

海栖热袍菌耐热葡聚糖内切酶EG12B基因的克隆表达及酶学特性分析

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家畜生态学报 2019年第4期40卷 20-26页

作者：王珊珊任艳艳张涛路宏朝王令陕西理工大学生物科学与工程学院陕西汉中723001 西北大学化工学院/陕西省可降解生物医用材料重点实验室陕西西安710069

为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性... 详细信息

为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性,运用基因工程手段将成熟肽EG12B基因克隆至原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组表达质粒pET28-EG12B。转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经重组菌发酵培养及IPTG诱导表达,实现了EG12B在大肠杆菌系统中的胞内高效表达,表达量约占全细胞总蛋白的36%。通过细胞超声破碎、镍离子亲和层析以及热处理分离纯化,获得了电泳纯重组酶EG12B。酶学特性分析表明,该重组酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为5.2,在70℃下保温1 h,酶活力基本维持不变。表明葡聚糖内切酶EG12B具有优越的耐热性和良好的热稳定性,为进一步作为饲料添加剂用于纤维素饲料关键技术的开发和畜产品品质的提升奠定了理论基础。

关键词：海栖热袍菌葡聚糖内切酶克隆表达酶学特性饲料添加剂

草菇（Volvarella volvacea）中葡聚糖内切酶在分泌途径中的定位及超微结构元件的分析与研究

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草菇（Volvarella volvacea）中葡聚糖内切酶在分泌途径中的定位...

作者：孙芳芳南京农业大学

学位级别：硕士

草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶，以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料，但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内，因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用。前期研究表明V.volva... 详细信息

草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶，以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料，但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内，因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用。前期研究表明V.volvacea可以产生三种纤维素酶即内切型纤维素酶(EC3．2．1．4)，外切型纤维素酶(EC3．2．1．9．1)和β-葡萄糖苷酶(EC3．2．1．21)等多种成分。本实验选择了内切型纤维素酶即葡聚糖内切酶EG1作为研究对象，重点研究了葡聚糖内切酶EG1在转录水平上的脉冲表达规律、在草菇菌丝中的定位及其分泌途径中涉及到的超微结构元件。Ding等已经对葡聚糖内切酶EG1的一些性质进行过深入研究，研究表明EG1的分子量为42KDa，等电点为7.65，最适PH和温度分别为7.5和55℃。在本实验中首先研究了葡聚糖内切酶基因eg1在V.volvacea中的表达是在转录水平上受诱导和代谢物抑制调控的，α-乳糖既为诱导物又为抑制物，加入α-乳糖于含有1％山梨醇的基本培养基中，3个小时后用RT-PCR方法检测到eg1的诱导表达，在6小时表达信号最强，随后9小时表达减弱，12小时后表达变得非常弱，24小时后，eg1的表达被强烈抑制。RT-PCR分析以gpd基因(三磷酸甘油醛脱氢酶基因)为内参基因。实验中用凝胶层析和制备型凝胶电泳纯化在毕赤酵母P.pastoris中获得高效分泌表达的重组葡聚糖内切酶EG1，然后用纯化的EG1来亲和层析纯化葡聚糖内切酶一级抗体，并做Western blotting验证了纯化的一级抗体的纯度及特异性。实验中用共聚焦激光扫描显微镜和免疫荧光标记方法来观察α-乳糖诱导与抑制循环中分泌的葡聚糖内切酶在草菇菌丝中的定位。首先将菌丝用葡聚糖内切酶一级抗体标记，然后用荧光染料Rhodamine结合的二级抗体进行标记，随后用共聚焦激光扫描显微镜观察到草菇菌丝中分泌的葡聚糖内切酶主要定位在菌丝细胞壁周围，标记荧光从菌丝尖端延伸大约60-80微米，且菌丝细胞壁周围能观察到明显的免疫荧光的信号强弱变化：乳糖诱导3小时后，可观察菌丝细胞壁周围有很弱但是唯一的免疫荧光信号，乳糖诱导6小时到8小时后，可在菌丝细胞壁周围观察到很强的免疫荧光信号，而9小时后免疫荧光开始减弱，12小时后荧光变得很弱。在未诱导菌丝中未观察到荧光标记。实验中用透射电镜和免疫金标记的方法来观察α-乳糖诱导与抑制循环中葡聚糖内切酶在菌丝中的分泌过程及分泌过程中涉及的超微组织结构。首先将菌丝包埋后的切片用葡聚糖内切酶一级抗体标记，然后用免疫胶体金颗粒(12nm)结合的二级抗体进行标记，随后用透射电镜观察表明草菇菌丝中葡聚糖内切酶的分泌经过内质网和液泡等组织结构，最终葡聚糖内切酶由小液泡携带至质膜处，与质膜融合后经过细胞壁而分泌到外部空间。以上实验结果初步分析了草菇菌丝体中葡聚糖内切酶分泌途径中的超微结构元件及这些元件在菌丝体中的空间分布模式，确定了该酶分泌的动力学机制。本研究结果对进一步深入研究草菇纤维素降解酶的合成和分泌，提高草菇生物学效率和产量奠定了基础，并对其它丝状真菌蛋白质分泌途径的研究提供参考。

关键词：草菇葡聚糖内切酶分泌途径定位超微结构鉴定

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绿色木霉葡聚糖内切酶基因的克隆和表达研究

绿色木霉葡聚糖内切酶基因的克隆和表达研究

作者：王利英广西大学

学位级别：硕士

纤维素酶主要分为三类:(1).葡聚糖外切酶(exo-1,4-β-D-glucana-ses)又称纤维二糖酶(cellobiohydrolases,简称CBH);(2).葡聚糖内切酶(endo-1,4-,β-D-glucanases,简称EG);(3).β—葡萄糖苷酶(1,4-β-D-glucosidases简称BG),三种组分协同作用,最终将纤维素水解生成葡萄糖;产纤维素酶的菌主要时有丝真菌,尤其是木霉、曲霉等,木霉产的纤维素酶主要是葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶,而曲霉主要是产β—葡萄糖苷酶能力较强。纤维素酶的合成成受纤维素、乳糖(lactose)、纤维二糖(cellobiose)、槐二糖(sophorose)和L-山梨糖(L-Sorbose)等的诱导。本文用L-山梨糖诱导绿色木霉AS3.3711纤维素酶基因的转录,在诱导9-12h时,葡聚糖内切酶的mRNA转录量达到峰值,收集菌丝体提取总RNA,反转录获得cDNA。以单链cDNA为模板,PCR扩增得到了编码葡聚糖内切酶Ⅰ的cDNA基因(egl1)和编码葡聚糖内切酶Ⅲ的cDNA基因(egl3),去除egl1和egl3的信号肽序列后分别构建了重组质粒pET-egl1和pSE-egl3,并实现了其在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析大肠杆菌的表达产物,结果表明egl1基因在大肠杆菌中表达的蛋白分子量约46.2kDa;egl3基因在大肠杆菌中表达的蛋白质分子量约42kDa。CMC酶活检测发现大肠杆菌表达的EGI没有酶活,大肠杆菌表达的EGⅢ检测到胞内酶活,每毫升菌液所含葡聚糖内切酶的活力为0.04U/ml。将含信号肽的egl1基因,克隆到酿酒酵母表达载体pYES2中,构建了重组质粒pYES2-egl1,转化酿酒酵母菌INVscl,β-D-半乳糖诱导EGI的表达,用刚果红染色法筛选重组转化子。酿酒酵母能够识别EGI自身携带的信号肽,而将表达产物分泌到胞外,故在CMC筛选平板上用刚果红染色法检测,有清晰的水解圈。用80%饱和度的硫酸铵从2ml菌液上清中沉淀酶蛋白,重悬于1ml的0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.8),CMCase测定结果显示,酿酒酵母INVsvl表达的EGI最适反应温度为47℃,最适反应pH为5.2,在诱导70h时酶活达到最高值,约为0.08U/ml。

关键词：绿色木霉酿酒酵母纤维素酶葡聚糖内切酶

不同碳源条件下草菇（Volvariella volvacea）葡聚糖内切酶诱导表达的分析

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不同碳源条件下草菇（Volvariella volvacea）葡聚糖内切酶诱导表...

作者：裴云南京林业大学

学位级别：硕士

草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶,以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料,但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内,因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用。前期研究表明V.volvace... 详细信息

草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶,以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料,但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内,因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用。前期研究表明V.volvacea可以产生三种纤维素酶即内切型纤维素酶即葡聚糖内切酶(EC3.***.1.4),外切型纤维素酶(EC3.***.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.***.1.21)等多种成分。本实验选择了葡聚糖内切酶EG1作为研究对象,研究了碳源对草菇葡聚糖内切酶合成的诱导调控机理。真菌纤维素酶是一种诱导酶,碳源同时也是主要的诱导物来源。实验中利用了western blotting技术检测了不同碳源诱导下EG1的分泌,结果发现草菇产纤维素酶的诱导源很宽,α-乳糖、纤维二糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、麸皮等均能诱导草菇产生EG1;在含有微晶纤维素的液体培养基中生长10天,EG1在草菇菌丝中有高效表达;在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇EG1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,分别在菌丝生长期、分化期、菇体成熟期EG1的分泌量达到最大。为了更深入的研究碳源对EG1的诱导表达,我们重点研究以α-乳糖、纤维二糖、山梨糖为碳源诱导草菇EG1的分泌,结果发现α-乳糖、纤维二糖均能诱导EG1的高效表达,而山梨糖却不能;又对不同浓度的α-乳糖和纤维二糖诱导24小时进行研究,结果发现在低浓度时也均能诱导EG1的表达,α-乳糖在浓度为0.5%诱导表达量最大,纤维二糖则是在浓度为2%诱导表达量最大;当两种糖共同作用时,山梨糖阻遏了α-乳糖对EG1的诱导,却对纤维二糖诱导影响不大;而当α-乳糖和纤维二糖共同作用时使EG1的表达滞后。实验中利用RT-PCR技术研究了草菇中葡聚糖内切酶基因eg1在α-乳糖诱导下转录水平的表达,加入α-乳糖诱导3个小时后用RT-PCR方法检测eg1的诱导表达,在4.5小时表达信号最强,随后9小时表达减弱,24小时后表达变得非常弱。

关键词：草菇葡聚糖内切酶碳源诱导 western blotting 半定量RT-PCR

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)基因克隆与表达

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中国酿造 2012年第7期31卷 114-116页

作者：陈红漫张璐李艳秋阚国仕任大明沈阳农业大学生物科技学院辽宁沈阳110186

绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株。通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导。本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡... 详细信息

绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株。通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导。本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡聚糖内切酶Ⅰ的mRNA转录达到峰值,收集菌丝提取总RNA,以单链cDNA为模板,PCR扩增获得编码葡聚糖内切酶Ⅰ基因(egl1),去除信号肽序列后构建重组质粒PET-egl1,实现其在大肠杆菌中的表达,所得重组葡聚糖内切酶经组氨酸标签亲和层析纯化得到单一的E-GI蛋白,SDS-PAGE检测为49ku,活力为2.37U/mL。

关键词：绿色木霉纤维素酶葡聚糖内切酶原核表达

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

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广西科学 2007年第3期14卷 315-319页

作者：王利英刘一杨登峰黄日波广西大学生命科学与技术学院广西南宁530004 广西科学院广西南宁530007

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识... 详细信息

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。

关键词：绿色木霉葡聚糖内切酶酿酒酵母