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萤火虫荧光素酶的性质和应用的研究

萤火虫荧光素酶的性质和应用的研究

作者：胡敬志华东师范大学

学位级别：硕士

萤火虫在夜晚可以发出荧光，其基本的生物化学反应是虫荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素并且放出荧光，可以用以下这个反应方程表示：荧光素+ATP+O(?)氧化荧光素+AMP+PPi+CO+light。此反应必须有ATP的参加而且其发光的强度与ATP... 详细信息

萤火虫在夜晚可以发出荧光，其基本的生物化学反应是虫荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素并且放出荧光，可以用以下这个反应方程表示：荧光素+ATP+O(?)氧化荧光素+AMP+PPi+CO+light。此反应必须有ATP的参加而且其发光的强度与ATP的浓度在一定的浓度范围内正相关。ATP广泛存在于生活细胞当中并且其含量在正常细胞的一生中相当的稳定。而ATP含量可以指示食品中以及其加工环境中微生物的数量和食物被污染的状况，因此这一方法不仅可以用于快速检测食品的安全，还可以检测食品接触面的卫生状况以便于严格控制食品工业的安全生产。此外，荧光素酶基因已广泛地做为报告基因，可以通过此反应检测基因的表达水平。目前萤火虫荧光素酶系统已经逐步应用到细胞的代谢研究、生物传感器、环境监测、药物筛选等领域。本研究选取提取自中华黄萤的发光器官的荧光素-荧光素酶系统为实验材料，首先是利用SDS-PAGE和HPLC分析计算了它和其他几种荧光素酶的分子量差别和纯度。为了建立该荧光素酶合适的反应条件，摸索了该酶促反应的动力学曲线特征、合适的缓冲液种类、离子浓度、温度和最适的pH值。确定一个比较合理的缓冲体系。几种金属离子和EDTA(乙二胺四乙酸)对酶活性的影响也做了探讨。同时荧光素酶在低温和常温下的稳定性，光对其稳定性的影响做了探讨，并且选取了几种保持其酶活性的稳定剂和避光的方法。建立上述基本的反应条件后，本研究还对DTT(二硫苏糖醇)、GSH(谷胱甘肽)、BSA(牛血清白蛋白)，DEAE-Dx(二乙氨乙基葡聚糖)以及CoA(辅酶A)等几种激活剂对酶活性的增强作用进行了系统的研究。同时关于一些表面活性剂和抑制剂对荧光素酶的作用也做了初步研究。本研究的结果表明，该荧光素酶较适的反应体系是HEPES缓冲液，最适pH值是5.5，与前人报道大部分荧光素酶最适pH值为7.6～7.8的结果不一致，显示此酶的特异性。最适的温度是20℃，最适离子强度在10-100mmol/L，分子量是64KD左右，是一种非典型的Michaelis-Menten氏酶，对底物之一的ATP动力学曲线为S型。该酶的提取纯度在80％，随着缓冲液pH的下降，该荧光素酶反应发射光谱峰值处的波长没有出现红移，其发射波长峰值波长始终在570nm附近，这点与北美萤火虫的性质有所不同。常温下该酶的性质不稳定，较易失活，对光也比较敏感，在空气中容易被氧化。BSA、DTT和GSH能够显著的保护和提高酶的活性，金属离子Mg、Mn和Ca能增强酶的活性。DEAE-DX和CoA能提高反应的发光强度。大部分的高浓度的金属离子和去污剂均会降低酶的活性，甚至使其完全失活。通过本研究，建立了一个比较理想的萤火虫荧光素酶-荧光素反应体系和操作方法。由于不同种类的荧光素酶的性质有一定的差异，所以本研究结果为更好的了解和利用萤火虫荧光素酶提供了一些有用的资料。

关键词：萤火虫荧光素酶荧光素三磷酸腺苷生物发光酶学性质

萤火虫荧光素酶及酿酒酵母ATP硫酸化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其应用

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萤火虫荧光素酶及酿酒酵母ATP硫酸化酶在大肠杆菌中的表达、纯化...

作者：蒋庆庆南京农业大学

学位级别：硕士

荧光素酶是由一条多肽链组成的高效生物催化剂。在ATP、Mg2+、O2等适宜的条件下,能够以荧光素为底物发生催化反应并发出荧光。本文将北美萤火虫荧光素酶基因克隆到大肠杆菌中,用随机突变的方法未筛选到对酸碱或温度耐受性增强的荧光素... 详细信息

荧光素酶是由一条多肽链组成的高效生物催化剂。在ATP、Mg2+、O2等适宜的条件下,能够以荧光素为底物发生催化反应并发出荧光。本文将北美萤火虫荧光素酶基因克隆到大肠杆菌中,用随机突变的方法未筛选到对酸碱或温度耐受性增强的荧光素酶突变体。分析酶的结构,发现其第232位的疏水性异亮氨酸的周围负电荷氨基酸太多,将异亮氨酸定点突变成带正电的赖氨酸后,连到表达载体pET30a(+)上,导入表达菌株BL21(DE3)中,获得高效表达萤火虫荧光素酶的重组菌Q2/pET30a-luc、 Q3/pET30a-luc-I232K,经镍柱纯化出目的蛋白后,测得突变体Luc(I232K比活力(4.68×1012RLU/mg)较Luc比活力(1.94×1012RLU/mg)高2.41倍。本实验发现底物ATP及荧光素对两种荧光素酶的反应动力学曲线均是s型的。Mg2+及CoA可以提高两种酶的活性,CoA还可延长发光时间,其最适浓度分别为10mM、20μM。本文还探究了几种不同的酶保存液对两种荧光素酶的影响。2.0mMEDTA、1.0mM DTT、30μg/mL BSA是保护这两种酶最适宜的条件。Luc在(NH4)2SO4或TritonX-100分别为1mM、0.1%时存活率最高,而突变体Luc(I232K)对(NH4)2SO4或TritonX-100耐受性更高,最适宜的浓度分别为2mM、0.15%。但这两种保护剂的浓度继续升高时会使两种酶的活性下降。突变体Luc(I232K)较Luc在pH5时活性更高,活性pH范围更广。其最适反应温度范围(22℃-28℃)较Luc(22℃～25℃)更宽。Luc(I232K)长时间存放于-20℃、4℃、22℃时,其酶存活率比Luc高。40℃保温5min后，Luc(I232K)、Luc酶存活率分别为77%、8.6%,放置1h后,Luc完全失活,Luc(I232K)酶存活率10%。将以上纯化的突变体Luc(I232K)应用于微生物细胞ATP含量的测定中,使用季铵盐类表面活性剂苯扎氯铵(BAC)提取细胞内ATP,其浓度在低于0.03%时,对荧光素酶活性干扰小,苯扎氯铵提取不同菌的ATP的最适浓度和时间为：霍乱弧菌0.02%、2min,大肠杆菌0.03%、3min,恶臭假单胞菌0.02%、3min,枯草芽孢杆菌0.01%、2min。本实验发现ATP浓度与发光强度相关性良好,同时细菌数目与生物发光强度在一定范围内也有良好的相关性,通过测定发光值推算出霍乱弧菌ATP含量约为0.24～0.45×10-18mmol/个,大肠杆菌ATP含量约为0.65-1.27×10-17mol/个,恶臭假单胞菌ATP含量约为0.14～0.2×10-16mol/个,枯草芽孢杆菌ATP含量约为0.08-0.25×10-16mo1/个,实验测得每种细菌的不同生长阶段ATP含量基本一样。将突变体Luc(I232K)应用到纳米材料ZnO对恶臭假单胞菌细胞活性的影响中,结果是纳米材料ZnO虽促进其生物膜形成,但对其细胞活性无影响,也可能是仪器检测ATP的下限不够低、ATP提取剂苯扎氯铵对荧光素酶Luc(I232K)活性有少许抑制作用及本实验方法不能用于检测细胞内ATP浓度的极其微量的变化。将萤火虫荧光素酶与ATP硫酸化酶偶联可以应用于PPi测定、DNA聚合酶活性测定等方面。通过将酿酒酵母ATP硫酸化酶基因met3连到表达载体pET30a(+)上,导入表达菌株BL21(DE3)中,获得了高效表达ATP硫酸化酶的重组菌Q4/pET30a-met3.将经镍亲和层析纯化后的ATP硫酸化酶与荧光素酶Luc(I232K)偶联来检测ATP硫酸化酶的活性及PCR产物中焦磷酸的释放量来评价DNA聚合酶的活性。纯化得到ATP硫酸化酶比活力为2.79×103U/mg.实验表明放置在4℃及28℃保存1个月后DNA聚合酶活性均下降。

关键词：萤火虫荧光素酶大肠杆菌纯化应用 ATP硫酸化酶

小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

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实用儿科临床杂志 2012年第13期27卷 987-989,993页

作者：秦大妮周泽民沈惠平余章斌韩树萍江苏大学附属宜兴市人民医院儿科江苏宜兴214200 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科南京210004

目的构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在P19细胞中的表达。方法采用PCR方法获得WNT1基因启动子最小功能单位和3'UTR区域在内的DNA片段。双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶... 详细信息

目的构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在P19细胞中的表达。方法采用PCR方法获得WNT1基因启动子最小功能单位和3'UTR区域在内的DNA片段。双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受WNT1启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-SV40(表达海肾荧光素酶)共转染P19细胞,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,空白对照组(荧光强度比值:2.820 4±0.294 4)与对照组(荧光强度比值:3.050 8±0.303 7)及WNT-3'UTR突变组(荧光强度比值:51.475 8±0.983 7)比较,差异均有统计学意义(Pa萤火虫荧光素酶。结论成功构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在P19细胞的特异性表达。

关键词： WNT1 P19细胞 pGL3-Basic 基因表达载体构建萤火虫荧光素酶

基于萤火虫荧光素酶的凋亡检测方法的建立及其在筛选结核分枝杆菌蛋白调控细胞凋亡中的应用

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基于萤火虫荧光素酶的凋亡检测方法的建立及其在筛选结核分枝杆菌...

作者：施俊伟华中农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,在组织分化、器官发育、机体稳态等生理过程中发挥着重要作用。尽管细胞凋亡是一种正常的生理现象,但是异常的细胞凋亡常引起许多疾病。调节宿主细胞凋亡是结核分枝杆菌致病性的一部分,影响结核分枝杆菌的生存、繁殖、扩散等过程。快速准确的检测细胞凋亡是研究凋亡相关机制以及评价凋亡对疾病过程影响的基础。Caspase-3的激活是细胞凋亡的重要标志,常被应用于凋亡检测方法的建立。为了方便快速的检测结核分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的影响,本研究将caspase-3的识别序列与萤火虫荧光素酶融合表达构建了一个新型的caspase-3报告质粒,用于细胞凋亡的检测,并筛选了部分结核分枝杆菌编码的蛋白,具体研究内容如下:***-3报告质粒的构建及验证本研究构建了四种caspase-3报告质粒,将四种报告质粒分别转染He La细胞,在细胞凋亡阳性刺激物刺激下,四种报告质粒荧光素酶的值明显增加,同时荧光素酶被切割,说明报告质粒构建成功。细胞凋亡发生时,233-Dna E-DEVDG激活超过25倍,其对照的值处于较低水平,而另外三种报告质粒和相应对照的值同时升高。这些结果说明233-Dna E-DEVDG背景值低、敏感性高,更适合应用于检测细胞凋亡。2.结核分枝杆菌ESAT-6家族蛋白的筛选将结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族真核表达质粒、233-Dna E-DEVDG和TK共转染He La细胞,通过双荧光素酶试验检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族成员对细胞凋亡的影响。实验发现esx A、esx T和esx L能激活233-Dna E-DEVDG并呈剂量依赖性,esx C不能激活233-Dna E-DEVDG。3.筛选结果的验证为了验证筛选结果的可靠性,本研究通过经典的细胞凋亡检测方法验证。Caspase-3在细胞凋亡相关通路中处于中心位置,是评价细胞凋亡的核心指标。本研究通过Western Blot检测发现esx A和esx T可以促进caspase-3的活化,阴性对照esx C不能促进caspase-3的活化;细胞凋亡检测试剂盒染色后,通过流式细胞仪检测发现esx A和esx T可以上调凋亡细胞比率。4.核因子-kB(NF-kB)参与esx T诱导的细胞凋亡NF-kB通路与细胞凋亡密切相关,在一定情况下,NF-kB激活是细胞凋亡所必须的。为探究NF-kB通路是否参与esx T诱导的细胞凋亡,本研究通过双荧光素酶试验检测发现esx T能激活NF-kB启动子并呈剂量依赖性,用BAY11抑制NF-kB的激活会导致esx T诱导的细胞凋亡水平部分下降,说明NF-kB的激活参与了esx T诱导的细胞凋亡。NF-kB通路主要通过促进其下游的促凋亡基因表达促进细胞凋亡,为进一步寻找esx T通过NF-kB调控了哪些促凋亡基因的表达,本研究通过Real-Time PCR和Western Blot检测发现esx T能在m RNA和蛋白水平上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的表达。这些结果说明esx T可能通过NF-kB上调其下游的TNF-α和TRAIL促进细胞凋亡。

关键词：细胞凋亡萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌 ESAT-6蛋白家族

表达萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子的构建与应用

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表达萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子的构建与应用

作者：王玢瑸西北农林科技大学

学位级别：硕士

【目的】兔病毒性出血症是发生于兔的一种急性、热性和致死性传染病，它对世界养兔业构成了严重威胁。加强对该病病原的基础和应用研究，可以为该病的综合防治提供理论依据和技术支撑。由于兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease vir... 详细信息

【目的】兔病毒性出血症是发生于兔的一种急性、热性和致死性传染病，它对世界养兔业构成了严重威胁。加强对该病病原的基础和应用研究，可以为该病的综合防治提供理论依据和技术支撑。由于兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)缺乏在体外增殖培养的细胞系，这严重阻碍了其分子生物学的基础研究。近年来，在杯状病毒科其它成员的研究中发现，该科病毒与其他正链RNA病毒在蛋白翻译起始与调控方面存在明显差异，猜测杯状病毒科病毒(包括RHDV)可能采用了一种新颖的翻译起始和调控机制，本文即利用反向遗传学技术对RHDV的翻译起始机制进行探讨性研究。【方法】（1）以RHDV JX/97株基因组全长cDNA克隆为模板，用PCR方法扩增RHDVVPg蛋白编码基因，将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，用IPTG诱导,使之高效表达。表达产物经镍柱纯化后免疫试验兔，制备抗VPg的多克隆抗体，用Western blot试验检测其特异性。（2）在RHDV全长基因组cDNA分子克隆的基础上，构建基于DNA质粒的含有萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）的病毒复制子，即用Fluc基因替换病毒结构蛋白编码区，依靠CMV启动子在哺乳动物细胞中进行转录和表达。利用RT-PCR、间接免疫荧光、Fluc活性分析和绘制复制子的动力曲线等方法检测复制子的表达情况;在此基础上，分别构建了缺失RHDV5’NCR(5’non-coding regions)，VPg和3D基因的复制子突变体，然后通过检测Fluc活性的变化,分析上述缺失突变对复制子蛋白表达的影响;为了进一步分析5’NCR和VPg基因的功能，我们在缺失3D基因的基础上，又分别构建了缺失5’NCR和VPg的双突变复制子，以qRT-PCR方法评价复制子在RNA水平的表达情况，以双荧光报告系统分析复制子在蛋白质水平的表达情况。最后，综合上述研究结果，初步确定与RHDV翻译相关因素。【结果】（1）构建了pET30a/VPg原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21菌株后，成功表达了VPg蛋白;将该蛋白免疫试验兔后，成功并制备了特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究RHDV的表达和调控机制提供了良好物质材料。（2）成功构建了携带萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子，用多种方法证明了该复制子能在RK13细胞中良好复制和表达;一步生长曲线分析表明，复制子在转染后24h表达达到峰值，随后逐渐下降;用反向遗传学技术证明了VPg，5’NCR和3D的缺失突变均能影响复制子表达，且以VPg影响最为显著;5’NCR和VPg对复制子mRNA水平的影响虽较小，但缺失突变体的蛋白表达水平差异却很显著，提示VPg和5’NCR与RHDV的蛋白翻译密切相关。【结论】（1）本研究表达的VPg蛋白，以及制备的特异性多克隆抗体为研究VPg的生物学功能奠定了基础;（2）本研究成功构建了携带荧光素酶基因的RHDV复制子，它在RK13细胞中能够良好复制和表达，为进一步研究RHDV的复制和翻译机制提供了良好的技术平台;（3）本研究利用反向遗传学技术证明RHDV的5’NCR,VPg和3D基因的缺失能下调报告基因的表达，初步揭示VPg和5’NCR与病毒的翻译相关。

关键词：兔出血症病毒 5’NCR VPg 复制子萤火虫荧光素酶

稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的猪瘟病毒的构建及其在抗病毒试验中的应用

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稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的猪瘟病毒的构建及其在抗病毒试...

作者：申梁中国农业科学院

学位级别：硕士

猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是猪瘟(Classical swine fever, CSF)的病原,猪瘟对养猪业的危害巨大,常造成重大经济损失,也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。目前,对猪瘟疫情的防控主要是通过疫苗接种和对感染猪瘟... 详细信息

猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是猪瘟(Classical swine fever, CSF)的病原,猪瘟对养猪业的危害巨大,常造成重大经济损失,也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。目前,对猪瘟疫情的防控主要是通过疫苗接种和对感染猪瘟病毒的猪进行严格扑杀和对周边地区进行消毒防疫。我国在国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)中将猪瘟列入优先防治的6种动物疫病之一,并计划进一步扩大猪瘟净化区域。为了快速检测CSFV抗体效价,判断疫苗免疫状况,建立针对CSFV特异性抑制剂的高通量筛选方法。本研究利用反向遗传学技术拯救了一株能够稳定表达萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Flue)基因的猪瘟报告病毒CSFV-Npro Fluc通过重叠PCR的方法将Fhuc基因克隆到基于RNA聚合酶Ⅱ的Shimen株全长感染性cDNA克隆pBRCISM的Npro编码区内。经RT-PCR、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR (real-time-PCR)检测显示病毒构建成功。测定病毒生长曲线后发现该报告病毒与亲本病毒Shimen株相比病毒滴度下降了近10倍。在连续传代的过程中发现该报告病毒所携带的Fluc基因并没有发生丢失,且病毒在传代的过程中感染性基本没有发生变化,证明了该报告病毒的稳定性。通过检测SK6细胞在感染报告病毒后不同时间点Fluc活性后发现CSFV的侵入过程相当迅速,最早可在感染报告病毒后4.5h内通过Fluc活性检测到CSFV Npro蛋白的表达。此外,研究证实通过检测Fluc活性值与直接用Western blot检测Npro蛋白表达量结果一致。为了进一步证明该病毒可以用于抗体效价测定以及抗病毒抑制剂的筛选,我们用该报告病毒对本实验室免疫攻毒后的50份血清进行了中和试验,同时用该报告病毒筛选了12个针对CSFV基因组不同区域的siRNA的干扰效果。结果表明,该报告病毒可以用于快速检测免疫血清的抗体滴度并且成功的筛选出了3个对CSFV的复制具有较强的干扰效果siRNA分子。总之,本研究首次构建了携带Fluc报告基因的重组CSFV,并证明了该报告病毒CSFV-Npro Fluc不仅可以用于抗体效价的快速测定,还可以作为筛选CSFV特异性抑制剂的有效工具。

关键词：猪瘟病毒 Npro蛋白萤火虫荧光素酶抗病毒筛选

基于稳定表达萤火虫荧光素酶Vero细胞系体外病毒中和活性检测方法的建立及应用

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中国生物制品学杂志 2024年第4期37卷 481-486,492页

作者：丁如霞李晓玉赵晨燕刘强姚佳维黄维金王佑春中国食品药品检定研究院北京102629 北京百奥赛图基因生物技术有限公司北京102629

目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CR... 详细信息

目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9靶向基因编辑技术,构建一种稳定表达fluc的Vero细胞系,在此基础上建立痘病毒和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染细胞活性检测方法,利用该方法评估痘病毒免疫血清及RSV单抗的中和活性,并与噬斑抑制法及细胞活力检测(adenosine triphosphate,ATP)法检测结果进行比较。结果成功构建了Vero-fluc细胞系,其细胞量与表达的fluc相关性良好(R^(2)=0.9948)。利用Vero-fluc细胞作为感染细胞验证的痘病毒中和活性检测方法具有良好的稳定性、可靠性[信噪比(signal/background ratio,S/B)=25],可满足高通量的检测需求(Z’=0.9),相比传统噬斑抑制法一致性强(R2=0.76),免疫血清的ID50值较噬斑法平均高出2倍。建立的RSV中和活性检测方法,检测的抗RSV单抗中和活性与ATP活性试剂盒检测结果一致,Vero-fluc细胞法在1∶103~1∶105的抗体滴度水平上抑制率显著高于ATP法。结论建立的基于Vero-fluc细胞系的病毒中和活性检测方法与传统方法相比,具有良好的相关性,结果可靠,且具有更高的灵敏度及检测通量,是一种通用型体外抗病毒中和活性评价方法。

关键词：萤火虫荧光素酶 Vero细胞高通量检测抗病毒活性中和活性

重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

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山东医药 2020年第9期60卷 32-35页

作者：廖亮王琴容杨国辉贵州医科大学附属医院贵阳550004 贵州省医学分子生物学重点实验室

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插... 详细信息

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。

关键词：荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因重组双荧光素酶报告基因嵌合体内含子基因质粒萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶细胞实验

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

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医学分子生物学杂志 2009年第5期6卷 387-390页

作者：贾玉红马天舒姜妙娜孙杰李淑艳贾弘禔大连医科大学病理生理学教研室辽宁省大连市116044 大连市中医研究所辽宁省大连市116013 北京大学医学部生物化学与分子生物学系北京市100191

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体，并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283），双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体，使萤火虫荧光素酶报告基因... 详细信息

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体，并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283），双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体，使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元，24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确，该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体，并检测到该载体在神经元中的特异性表达。

关键词： GluR2 神经元 pGL3-Basic 基因表达构建萤火虫荧光素酶