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鸡GNAS基因c.36-2277T>C突变对萤光素酶表达的影响

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2019年第2期45卷 237-242页

作者：王欢欢张雷葛莹宋丹丹楼立峰章学东杭州市农业科学研究院杭州310024

为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277T>C突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277T>C突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明... 详细信息

为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277T>C突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277T>C突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明:样本芦花鸡均为TT基因型,乌骨鸡均为CC基因型;c.36-2277T>C突变点的上下游-175～+818 bp片段具有显著增强转录活性作用(PC突变点的碱基类型会对基因转录调控进程产生重要影响,且该突变可能是通过与上下游转录因子结合位点共同作用来发挥效用。

关键词：鸡 GNAS 基因突变萤光素酶

利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统检测白细胞介素1及白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性

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北京大学学报（医学版） 2006年第6期38卷 653-656页

作者：张颖妹王应徐茜梅吕冰峰马大龙北京大学基础医学院免疫学系北京100083 北京大学人类疾病基因研究中心北京100083

目的:利用NFκ-B转录活性萤光素酶报告系统,建立新的白细胞介素1(interleuk in-1,IL-1)和白细胞介素1受体拮抗剂(interleuk in-1 receptor antagon ist,IL-1 ra)生物学活性的检测方法。方法:运用萤光素酶转录报告系统,选用小鼠胸腺瘤细... 详细信息

目的:利用NFκ-B转录活性萤光素酶报告系统,建立新的白细胞介素1(interleuk in-1,IL-1)和白细胞介素1受体拮抗剂(interleuk in-1 receptor antagon ist,IL-1 ra)生物学活性的检测方法。方法:运用萤光素酶转录报告系统,选用小鼠胸腺瘤细胞系EL4细胞(EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体表达),以pNFκ-B-luc质粒和内对照pRL-TK质粒共转染,并加入IL-1β激活,以双萤光素酶报告基因检测系统检测IL-1β及其抑制剂IL-1 ra的生物学活性。结果:这种方法检测到IL-1β激活NFκ-B报告基因表达萤光素酶,并且这种激活可被IL-1 ra所抑制,实验重复性好。IL-1β在5μg/L为激活NFκ-B报告基因表达萤光素酶的最佳浓度,并可被IL-1 ra 50μg/L最大抑制。结论:这种检测方法的建立为今后对IL-1β和IL-1 ra的生物学活性检测提供了新的途径。

关键词： NF-κB 白细胞介素1 受体,白细胞介素1 萤光素酶

萤光素酶报告基因检测法初步探究甲状腺肿瘤与女性体内孕激素水平关系

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萤光素酶报告基因检测法初步探究甲状腺肿瘤与女性体内孕激素水平...

作者：杨岭荣浙江理工大学

学位级别：硕士

甲状腺肿瘤是一种常见的颈部肿瘤,其发病率女性明显高于男性,因而很多学者认为这种差异性很可能与男女体内性激素水平有关。孕激素是一种雌性激素,主要在生殖、发育系统上发挥作用。但是随着孕激素类药物被广泛应用在医疗、畜牧业和农... 详细信息

甲状腺肿瘤是一种常见的颈部肿瘤,其发病率女性明显高于男性,因而很多学者认为这种差异性很可能与男女体内性激素水平有关。孕激素是一种雌性激素,主要在生殖、发育系统上发挥作用。但是随着孕激素类药物被广泛应用在医疗、畜牧业和农业等上,给社会带来巨大贡献的同时,也给环境带来了严重的激素污染,已经开始影响到生物体自身的内分泌系统。孕激素受体(Progesterone receptor,PR)属于核受体,只有当PR被孕激素激活后才能结合到孕激素受体应答元件的DNA区域,从而启动受体应答元件下游靶基因的表达。本课题利用这种机制并将萤光素酶报告基因克隆到受体应答元件下游,从而建立了一种高灵敏度、高通量的可用于孕激素水平生物检测的稳转细胞株,并将其应用于甲状腺相关肿瘤病人血液中的孕激素类物质水平的检测分析,以期探究孕激素类物质与甲状腺肿瘤发生的关联性。本研究共构建了含有孕激素受体基因的3种不同表达载体和3种含有不同串联倍数的孕激素受体应答元件片段的载体,通过萤光素酶的活性分析,利用质粒共转染技术将活性最高的一对重组质粒pEGFP-N2-hPR/pGL4-PRE4转染到HeLa细胞中,然后经过抗生素筛选和有限稀释法挑选出10个单克隆细胞株。再利用分子克隆技术、亚细胞定位技术鉴定出阳性单克隆细胞株。从第5代到第23代细胞的萤光素酶活性的检测结果表明该细胞株具有较强的遗传稳定性和较高的灵敏度,其检出限可以达到10 pM。因此,该稳转细胞株与萤光素酶活性检测技术结合起来即建立孕激素检测分析系统。同时,还观察到细胞株的萤光素酶活性随着外界环境中孕激素浓度的升高而增强,但是浓度高于106 pM孕激素反而会降低萤光素酶活性甚至是引起细胞死亡,这也可以说明环境中孕激素长期污染能给动物和人类健康造成危害,人类应该更加高度重视环境激素污染问题。为了研究孕激素水平和女性甲状腺肿瘤高发率之间的关联性,本研究利用孕激素受体的稳转细胞株检测分析系统对甲状腺相关肿瘤疾病的女性患者血清中孕激素水平进行检测分析。经过生物统计学分析发现,甲状腺癌病人的血清中孕激素水平低于与正常人血清中孕激素水平,并且有26.7%甲状腺肿瘤病人血清种孕激素平均水平低于1 nM,而正常组血清孕激素平均水平都高于1 nM;正常组中有22.7%样品的孕激素水平超过50 nM,而甲状腺肿瘤组中却没有。通过差异性分析显示甲状腺肿瘤组和正常组的孕激素水平存在显著性差异。尽管女性体内孕激素水平的波动较大,但本研究发现甲状腺肿瘤患者血液中的孕激素水平明显低于正常人血液中孕激素水平,提示在一定范围内甲状腺肿瘤患者肿瘤的发生与体内孕激素水平呈现负相关,故深入研究女性血液中孕激素水平可能对于甲状腺肿瘤早期诊断具有一定的参考价值。

关键词：孕激素孕激素受体萤光素酶甲状腺肿瘤

小鼠Omi/HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体的构建及转录活性分析

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中国病理生理杂志 2015年第10期 1907-1908页

作者：刘丹武烨刘鑫刘慧荣首都医科大学

目的:通过构建小鼠Omi/HtrA 2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析,深入研究小鼠Omi/HtrA 2转录调控发生的机制。方法:本实验构建覆盖小鼠Omi/HtrA 2基因5’侧翼区（-1 205 bp;93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体... 详细信息

目的:通过构建小鼠Omi/HtrA 2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析,深入研究小鼠Omi/HtrA 2转录调控发生的机制。方法:本实验构建覆盖小鼠Omi/HtrA 2基因5’侧翼区（-1 205 bp;93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体,将其转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3、大鼠心肌细胞H9c2和人胚肾细胞HEK293,并进行萤光素酶活性检测。结

关键词：报告载体 Omi/HtrA2 小鼠小家鼠转录活性萤光素酶基因启动子

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值得重视的新型酶试剂—萤光素酶

中国生物工程杂志 1990年第3期 34-36页

作者：孙万儒中国科学院微生物研究所

六十年代在研究萤火虫尾部发光机理中,发现了萤光素酶。之后人们又发现了许多结构上差异很大的多种萤光素酶。但研究最多的是萤火虫产生的萤光素酶和由海洋发光细菌产生的萤光素酶。它们所催化的底物——萤光素的结构非常不同,前者为6... 详细信息

六十年代在研究萤火虫尾部发光机理中,发现了萤光素酶。之后人们又发现了许多结构上差异很大的多种萤光素酶。但研究最多的是萤火虫产生的萤光素酶和由海洋发光细菌产生的萤光素酶。它们所催化的底物——萤光素的结构非常不同,前者为6—羟基苯并噻唑,而后者为脂肪醛。它们催化的生物发光机理为:

关键词：萤光素酶萤火虫细菌 Ag ATP 酶试剂 NADH

EGFRL858R和萤光素酶共表达转基因报告小鼠模型的构建

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EGFRL858R和萤光素酶共表达转基因报告小鼠模型的构建

作者：曹萍中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是ErbB家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。据报道在一些对酪氨酸激酶抑制剂敏感的肺癌患者中发现了EGFR基因酪氨酸激酶结构域的突变。一些非小细胞肺癌... 详细信息

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是ErbB家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。据报道在一些对酪氨酸激酶抑制剂敏感的肺癌患者中发现了EGFR基因酪氨酸激酶结构域的突变。一些非小细胞肺癌患者的EGFR基因具有特定的突变,这些突变与临床上肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼敏感有关。EGFR酪氨酸激酶抑制剂成为非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗的研究重点。本研究拟构建在对酪氨酸激酶抑制剂敏感的非小细胞肺癌患者中常见的几种EGFR突变,并构建其中一种突变体EGFRL858R和萤光素酶(Luciferase)共表达的转基因报告小鼠,这种小鼠可以通过活体动物体内生物萤光成像技术实时地观察肿瘤的发生发展过程,为非小细胞肺癌EGFR靶向治疗提供方便的研究工具。 Tet-On Advanced系统是一种在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系。在Tet-On Advanced系统中,外源基因的表达是通过加入诱导剂doxycycline (Dox)来开启的,这使得目的基因的表达可以随Dox浓度的不同而得到严密的控制。Tet-On系统对于外源基因表达的调控是高效且稳定的。它是通过Tet阻遏蛋白(TetR)作用于大肠杆菌Tn10转座子中的四环素操纵子起作用的。TetR在没有诱导剂存在的情况下结合在Tet操纵子(TetO)上阻遏目的基因的表达,在诱导剂存在的条件下TetR与TetO分离,基因表达被启动。为了实现突变型EGFR基因在转基因小鼠肺组织中特异性表达,我们选用肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性蛋白A(SP-A)启动子指导Tet-On系统逆向四环素反式作用因子rtTA的表达。本研究应用PCR技术,从小鼠基因组DNA中扩增出SP-A启动子并克隆入pGEM-T载体进行测序鉴定。用SP-A启动子替换pTet-On载体的CMV启动子,获得pSP-rtTA载体。设计一对搭桥引物,RT-PCR法从人肺癌A549细胞中分段扩增EGFR cDNA,通过搭桥PCR获得人EGFR全长cDNA。用定点突变的方法获得L858R、delE746-A750和delE746-A750/T790M三种EGFR突变型,并分别将其克隆入pTRE-Tight-BI-L载体得到载体pTRE-EL-1、pTRE-EL-2和pTRE-EL-3。用pSP-rtTA质粒转染人小细胞肺癌NCI-H446细胞,通过G418筛选获得表达Tet-On系统调节元件rtTA的阳性细胞H446-SP-rtTA,通过细胞亚克隆后获得21个转pSP-rtTA基因的细胞单克隆。RT-PCR法检测rtTA基因并通过瞬时转染pTRE-Tight-BI-L载体加强力霉素Dox诱导检测萤光素酶活性确认rtTA的表达后,将p TRE-EL-1质粒转染能稳定表达rtTA的单克隆细胞,潮霉素筛选获得能诱导表达EGFRL858R和萤光素酶基因的H446-rtTA-EL-1细胞,通过细胞亚克隆后得到细胞单克隆13个,加Dox诱导后RT-PCR法鉴定EGFR基因和萤光素酶基因的表达。不同浓度强力霉素Dox诱导转基因细胞H446-rtTA-EL-1后,测定萤光素酶活性,同时Western Blot法检测EGFR的表达。结果显示萤光素酶和EGFR基因的表达均与诱导物浓度呈正相关关系。这些结果表明我们建立的四环素诱导表达体系是有效的,可以用于体内研究。将pSP-rtTA经HindⅢ酶切回收2.6 kb片段、纯化后,显微注射到小鼠受精卵雄原核中。共获得465枚注射卵,这些卵分别移植到17只假孕母鼠的输卵管中,其中13只母鼠怀孕,移植成功率为76.47%,小鼠出生总数121只,经基因组DNA的PCR检测,其中15只小鼠为阳性(雄性9只,雌性6只),阳性率为12.40%。将pTRE-EL-1经ScaⅠ酶切线性化、纯化后,显微注射到小鼠受精卵雄原核中,共获得360枚注射卵,这些卵分别移植到12只假孕母鼠的输卵管中,其中10只母鼠怀孕,移植成功率为83.33%,小鼠出生总数94只,经基因组DNA的PCR检测,其中6只小鼠为阳性,阳性率为6.38%。将首建者小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠交配,子代经PCR检测鉴定阳性小鼠。取SP-rtTA小鼠的肺、脑、胃、心、肝、脾、肾等器官RT-PCR法检测rtTA的表达,结果显示转基因小鼠仅在肺部表达rtTA基因,其它器官没有表达。将能够表达rtTA的转基因小鼠大量繁殖,用于下一步杂交。将两种转基因小鼠杂交,子代小鼠中经Dox诱导后,RT-PCR检测到表达EGFR和萤光素酶基因的为阳性双转基因报告小鼠。

关键词：表皮生长因子受体萤光素酶 Tet-On Advanced诱导表达系统活体动物体内成像转基因

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用于基因调控研究的萤光素酶检测系统

基础医学与临床 1994年第1期14卷 61-63页

作者：方福德中国医学科学院中国协和医科大学

用于基因调控研究的萤光素酶检测系统方福德（中国医学科学院，中国协和医科大学北京１００００５）一、原理概述为了研究哺乳类动物和人类基因的表达调控机理，特别是研究基因顺式作用元件（Ｃｉｓ─ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）的作... 详细信息

用于基因调控研究的萤光素酶检测系统方福德（中国医学科学院，中国协和医科大学北京１００００５）一、原理概述为了研究哺乳类动物和人类基因的表达调控机理，特别是研究基因顺式作用元件（Ｃｉｓ─ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）的作用特点，需将克隆化基因转染哺乳动物...

关键词：萤光素酶检测基因调控

萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达

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生物技术通讯 2014年第6期25卷 792-795页

作者：朱晓明李盼王琳王宇张亮徐元基杜芝燕于继云阎瑾琦军事医学科学院基础医学研究所北京100850 解放军316医院北京100093

目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-l... 详细信息

目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-luc,瞬时转染293T细胞,采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证,并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果:经菌液PCR鉴定和测序验证,p EE14.1-luc与预期设计完全一致;流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%,免疫荧光检测可见绿色荧光表达,Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带;同时,利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论:p EE14.1-luc表达质粒构建成功,为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。

关键词：萤光素酶 pEE14.1载体活体成像

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萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用

生物技术通讯 2015年第1期26卷 131-134页

作者：赵海卫韩佩君吕欣尹文第四军医大学基础部微生物学教研室陕西西安710032

萤光素酶是一类在氧气存在下能催化其底物特异性发光的酶,检出灵敏度高、特异性强。萤光素酶催化底物发光因无须外源光的激发,避免了非特异性干扰,具有其他报告基因不可替代的优势。萤光素酶基因作为报告基因已成为医学科学研究领域的... 详细信息

萤光素酶是一类在氧气存在下能催化其底物特异性发光的酶,检出灵敏度高、特异性强。萤光素酶催化底物发光因无须外源光的激发,避免了非特异性干扰,具有其他报告基因不可替代的优势。萤光素酶基因作为报告基因已成为医学科学研究领域的重要标记工具,具有良好的应用前景。我们简要综述了萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用进展。

关键词：萤光素酶报告基因病毒