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萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）XW2发酵条件优化

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萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）XW2发酵条件优化

作者：朱均淼北京林业大学

学位级别：硕士

萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）XW2为本实验室从杨树健康叶片中分离保存的一株拮抗菌株。该菌株抑菌谱广,对多种病原真菌都有较强的抑制作用,是一株具有广泛应用前景的菌株。本文在前期研究的基础上,对萎缩芽孢杆菌XW2的基础发酵... 详细信息

萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）XW2为本实验室从杨树健康叶片中分离保存的一株拮抗菌株。该菌株抑菌谱广,对多种病原真菌都有较强的抑制作用,是一株具有广泛应用前景的菌株。本文在前期研究的基础上,对萎缩芽孢杆菌XW2的基础发酵培养基进行筛选,并对该培养基及菌株的发酵条件进行优化,得到最适发酵培养基配方和发酵条件,并利用10 L液体发酵罐进行扩大培养,绘制菌株的生长曲线以及确定其最适放罐时间,初步研制了萎缩芽孢杆菌XW2的生防菌剂。采用菌丝生长速率法检测该菌剂对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黑腐皮壳菌（Cytospora ambiens）、犁头霉（Absidia sp.）和杨树炭疽菌（Colletotrichum populi）等4株病原菌的抑菌活性,为实现萎缩芽孢杆菌XW2生防菌剂的大规模商品化生产和应用奠定了重要基础。主要结果如下:（1）筛选得到最适发酵培养基:碳源为麸皮15g,氮源为大豆蛋白胨5g,以及硫酸锰0.1 g,碳酸钙3 g,蒸馏水1 L,pH为7.0。（2）最适发酵条件:初始pH 6.5,装液量100 mL/250 mL锥形瓶,以3%接种量,在摇床转速200 rpm、温度30℃条件下达到最佳活菌量。（3）通过10 L发酵罐扩大培养确定了最适放罐时间为27 h,活菌量达到1.33×109cfu/mL。（4）用碳酸钙载体吸附初步制得XW2菌剂,检测得XW2菌剂对4种病原菌生长过程均产生影响,且抑菌活性较强,抑菌中浓度EC50值分别为4.74 mg/mL、3.33 mg/mL、4.01 mg/mL、3.32 mg/mL。

关键词：萎缩芽孢杆菌发酵培养菌剂抑菌活性

萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）抑制黄曲霉的作用研究

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萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）抑制黄曲霉的作用研究

作者：刘丁四川农业大学

学位级别：硕士

黄曲霉(Aspergillus flavus)及其毒素(AFT)对粮食产品、各种食品和饲料的污染严重威胁到人、畜健康,各种产品的安全无毒贮存是现今国内外关注的问题,其中黄曲霉及其毒素的生物防治已成为研究的热点,并且由于其对环境友好、防治效果明显... 详细信息

黄曲霉(Aspergillus flavus)及其毒素(AFT)对粮食产品、各种食品和饲料的污染严重威胁到人、畜健康,各种产品的安全无毒贮存是现今国内外关注的问题,其中黄曲霉及其毒素的生物防治已成为研究的热点,并且由于其对环境友好、防治效果明显等优势越来越受到人们的重视。分离筛选出对黄曲霉具有抑制作用的拮抗菌,并采用生物化学方法分离提取抑制黄曲霉生长和产毒的有效成分,从机理上阐明拮抗菌的作用途径,既有理论价值,又有实践意义。本论文旨在将实验室前期从土壤中分离筛选的1株对黄曲霉具有拮抗作用的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)进一步深入研究。从营养竞争、直接寄生、诱导寄主抗性和抗生作用多个方面探讨该株拮抗菌抑制黄曲霉的作用途径。营养竞争作用从萎缩芽孢杆菌对黄曲霉生长的抑制和对其孢子萌发的抑制两方面进行探讨。结果表明,萎缩芽孢杆菌的各处理液对黄曲霉的生长及孢子萌发均有-定作用;其中培养液原液和菌体悬浮液的效果最好,说明萎缩芽孢杆菌与黄曲霉之间具有明显的营养竞争关系;无菌上清液也表现出对黄曲霉生长的抑制作用。直接寄生作用从萎缩芽孢杆菌对黄曲霉菌丝生长的抑制和对菌丝形态的影响两方面进行探讨。结果表明,萎缩芽孢杆菌的培养液原液对黄曲霉菌丝生长的抑制效果最佳,其次是萎缩芽孢杆菌的菌体悬浮液,无菌上清液和经高压灭菌处理的培养液对黄曲霉菌丝生长几乎无影响。经培养液原液和菌体悬浮液处理的菌丝形态明显变异,呈现出扭曲、散乱、中部膨大呈念珠状、部分细胞内容物流出呈空腔、局部消融等特征。诱导寄主抗性作用采用接种黄曲霉和萎缩芽孢杆菌不同处理液至花生样品上的方法,通过测定抗性相关酶(SOD, CAT, PAL, POD, PPO)的活性变化来进行探究。结果表明,萎缩芽孢杆菌的各处理液能有效的提高SOD酶活性和POD酶活性,使CAT酶活性下降,但对PAL酶活性和PPO酶活性的诱导作用不明显。通过营养竞争作用和诱导寄主抗性研究发现,萎缩芽孢杆菌培养液无菌上清液中可能含有一种或几种萎缩芽孢杆菌的次级代谢产物,具有拮抗黄曲霉的作用,这说明萎缩芽孢杆菌对黄曲霉具有抗生作用。通过正交实验优化发酵条件,确定最佳发酵条件为：培养温度35℃,培养时间48h,接种量1.5%,摇床转速180r/min,培养基初始pH7.0,液体培养基装液量30mL。从硫酸铵沉淀、浓盐酸沉淀、乙醇沉淀和有机溶剂萃取多种方法中确定80%饱和度硫酸铵沉淀作为粗提的方法。并通过SephadexG-25脱盐和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化培养液中的抗菌活性物质;再由SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE电泳方法检测抗菌蛋白的分子量,发现SDS-PAGE电泳中无蛋白条带显示,Tricine-SDS-PAGE小肽电泳,经银染后可明显看到一条蛋白条带,其分子量约为5.8KDa。液质联用检测后通过重合率大小比对,发现抗菌活性物质与各蛋白质的氨基酸序列相似性均不太高,其中相似性最高的蛋白YnfF protein与之重合率仅为17.61%,这表明该抗菌活性物质很可能不是这些蛋白质中的一种,推测其可能为一种尚未见研究报道的新物质。通过红外光谱扫描证实萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质的主要成分是蛋白质,且其中主要包含的基团有：N-H、C-H、-C=C=C-、C-N。抗菌活性物质的生物学特性研究结果表明,抗菌活性物质的热稳定性、pH稳定性和有机溶剂耐受力较好,木瓜蛋白酶能降解其中部分的抑菌物质,但仍具有一定的抑菌活性;茚三酮和双缩脲反应均呈阳性。该物质对多种病原真菌具有抑制作用,具有广谱抑菌效果;确定其最低抑菌浓度为20μg/mL;抗菌效价研究发现,1mL抗菌活性物质中有效抑菌成分的含量相当于约1.5mg山梨酸钾。抗菌活性物质在活体上对黄曲霉生长的抑制实验结果表明,不同浓度抗菌活性物质处理的花生上,黄曲霉的生长均受到明显的抑制,并且随着花生上蛋白质含量的增多,黄曲霉的生长量逐渐减少,当蛋白浓度达到80μg/mL时,肉眼几乎看不到黄曲霉的生长。

关键词：萎缩芽孢杆菌黄曲霉抑菌作用

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萎缩芽孢杆菌的生物检测方法研究

萎缩芽孢杆菌的生物检测方法研究

作者：龚海燕华东师范大学

学位级别：硕士

萎缩芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的一类变种,在含有碳水化合物的培养基上可形成可溶性黑色菌落。目前,国内外许多研究致力于萎缩芽孢杆菌的应用研究,对该菌的检测方法研究甚少,没有成熟的、简便的方法可供借鉴。因此,本文从萎缩芽孢杆菌生物... 详细信息

萎缩芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的一类变种,在含有碳水化合物的培养基上可形成可溶性黑色菌落。目前,国内外许多研究致力于萎缩芽孢杆菌的应用研究,对该菌的检测方法研究甚少,没有成熟的、简便的方法可供借鉴。因此,本文从萎缩芽孢杆菌生物学特性对其进行系统研究,探索一种快速、准确、可靠的生物检测方法,对今后萎缩芽孢杆菌更广泛、更体系化的应用具有重要意义。本研究借鉴芽孢杆菌的鉴定方法,选用在消毒灭菌上广泛应用的ATCC9372菌株作为萎缩芽孢杆菌的代表菌株进行研究,提出了萎缩芽孢杆菌检测的生理化方法和PCR技术方法。首先,根据生理化试验研究,归纳了萎缩芽孢杆菌的生理化特征,提出了萎缩芽孢杆菌的传统生物鉴定方法：先通过镜检筛选确定芽孢杆菌,然后用API50CHB试剂条检测糖酵解利用能力,最后通过厌氧生长、硝酸盐利用、V.P试验、淀粉分解、10%NaCl生长、精氨酸利用等项目作为萎缩芽孢杆菌的确证项目进行鉴定。其次,在分子检测方面,通过筛选具有种特异性的引物(recA和ITS引物),优化PCR反应的退火温度,最终确定扩增条件。结果显示,萎缩芽孢杆菌对recA和ITS两种特异性引物分别产生131bp和75bp大小的目的条带,而其他9种芽孢杆菌对以上两种引物均无特异性扩增。可见这两种引物具有良好的特异性。最后,用环境样品对萎缩芽孢杆菌的生理化检测方法和PCR技术进行验证试验。两种方法检出效果良好,其中,生理化检测方法技术要求低,适用性广,但是耗时长,操作麻烦,结果不稳定,易受接种菌量及环境变化而变化;PCR鉴定方法准确、迅速,特异性强,但是仪器和技术要求相对较高。综上所述,本论文成功建立了萎缩芽孢杆菌的生物检测方法—生理化鉴定方法和PCR技术,为萎缩芽孢杆菌应用研究和开发提供了便利。

关键词：萎缩芽孢杆菌 PCR技术 recA基因生物检测

萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的纯化鉴定及其抑菌机制研究

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萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的纯化鉴定及其抑菌机制研究

作者：于地美北京林业大学

学位级别：硕士

由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨树炭疽病导致树势衰弱,严重影响并制约杨树正常的生长发育及生态功能的发挥,对经济和生态效益造成巨大损失。对杨树炭疽病的流行及防治已有很多研究,但由于胶孢炭疽菌的侵染机制复... 详细信息

由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨树炭疽病导致树势衰弱,严重影响并制约杨树正常的生长发育及生态功能的发挥,对经济和生态效益造成巨大损失。对杨树炭疽病的流行及防治已有很多研究,但由于胶孢炭疽菌的侵染机制复杂,目前仍未找到有效的控制办法。因此,明确抑制胶孢炭疽菌生长以及附着胞形成的抑菌物质,探究其靶标位点和作用的基因调控网路,有助于为开发新的杀菌剂以及控制病害提供理论依据。本研究对健康杨树叶片内生细菌——萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrosphaeus)XW2的胞外蛋白进行纯化鉴定,并研究其对胶孢炭疽菌的抑制作用,主要结果如下:(1)通过盐析、柱层析以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法从菌株XW2的发酵液中获得一个抑制附着胞形成的电泳纯抑菌蛋白,其分子量约为20 kDa,等电点约为4.89,并将其命名为BaAFP。(2)明确了 BaAFP的种类为一种2-Cys peroxiredoxin。基于液质联用技术(LC-MS/MS)获得的质谱数据与UniProt数据库比对,得到1 1个特异性匹配的肽段序列,并以萎缩芽孢杆菌XW2基因组DNA为模板,克隆获得BaAFP编码基因,确定其ORF为543 bp,编码180个氨基酸,具有PRXyp2cys保守结构域,分子式为 CHNOS。(3)构建了 pETM30-BaAFP表达载体,通过BL21(DE3)大肠杆菌表达了具有生物活性的重组BaAFP,并确定了最佳镍柱纯化洗脱液的咪唑浓度为150mM。(4)明确了 BaAFP对孢子萌发没有抑制作用,但影响芽管的萌发、附着胞的形成,会造成菌丝分支及菌丝内隔膜的增多,同时影响胶孢炭疽菌细胞内脂滴及活性氧的分布。通过大肠杆菌原核表达获得重组BaAFP,处理胶孢炭疽菌孢子。培养3-8 h期间,胶孢炭疽菌萌发孢子和芽管内脂质物质增多,孢子内脂质物质不随芽管伸长而减少,同时细胞内活性氧不在芽管尖端积累;12h-20h期间,伸长菌丝加粗,长度变短且分支增多。0.5mg/mL及以上浓度BaAFP处理的胶孢炭疽菌不在gel-bond膜上形成附着胞,0.1 mg/mL及以下浓度的BaAFP处理下,胶孢炭疽菌产生少量附着胞。在BaAFP处理40 h后,继续产生少量畸形附着胞,且在PEG4000处理后崩塌。0.1 mg/mL BaAFP处理导致胶孢炭疽菌在洋葱表皮上不形成附着胞,且菌丝徒长。在杨树叶片上,2mg/mLBaAFP处理的接种部位不产生病斑,但是出现活性氧聚集的情况。

关键词：胶孢炭疽菌萎缩芽孢杆菌胞外蛋白原核表达附着胞

萎缩芽孢杆菌XW2对苹果树腐烂病的防效评价

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萎缩芽孢杆菌XW2对苹果树腐烂病的防效评价

作者：王敏新疆农业大学

学位级别：硕士

腐烂病已成为危害苹果树的重要病害之一,在新疆主要苹果产区普遍发生。随着人们越来越关注食品安全的问题,利用生物防治技术控制病害已成为近年来研究的热点。萎缩芽孢杆菌XW2对多种植物病害病原菌有较好的抑菌活性,本文利用该菌进行了... 详细信息

腐烂病已成为危害苹果树的重要病害之一,在新疆主要苹果产区普遍发生。随着人们越来越关注食品安全的问题,利用生物防治技术控制病害已成为近年来研究的热点。萎缩芽孢杆菌XW2对多种植物病害病原菌有较好的抑菌活性,本文利用该菌进行了室内抑菌试验以及室内和田间防效试验,对其防治效果进行评价。取得结果如下:***2对不同种类壳囊孢真菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用,且不同种类间存在差异。XW2菌体对病原菌的菌丝生长抑制率均达到60.00%以上,最高为89.50%;其发酵滤液对病原菌的抑菌圈直径最高为3.23 cm,孢子萌发抑制率最高为71.86%。2.室内防效试验表明,XW2发酵液可以抑制病原菌的侵入和扩散,处理后的病斑面积明显小于无菌水对照,并且空白培养基没有对病原菌的扩散产生影响的成分;其对苹果树离体枝条表现出较强的保护作用和治疗作用,对5个不同品种的保护作用防效均在97.95%以上,治疗作用中的横纵切割法的防效在70.76%以上。3.田间防效试验结果与室内一致,XW2发酵液对苹果树腐烂病表现出一定程度的保护作用和治疗作用,保护法的防效高于治疗法,治疗法中,横纵切法的防治效果高于直接涂抹法。4.在田间防效试验中,发酵液处理的绚丽海棠和新冠的防效分别为55.50%和47.08%,杀菌剂和混合液的防效均在60.00%～70.00%之间,无显著差异,混合使用XW2发酵液和化学杀菌剂可以起到防治苹果树腐烂病的作用。

关键词：苹果树腐烂病萎缩芽孢杆菌室内田间防效评价

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萎缩芽孢杆菌检测方法的制定

萎缩芽孢杆菌检测方法的制定

作者：马顶虹华东师范大学

学位级别：硕士

与大部分其他类型的微生物相比,微生物芽孢通常认为对灭菌处理更有抗性。萎缩芽孢杆菌适合作为指示微生物用于检验干热、环氧乙烷、微波以及电热灭菌效果。由于其芽孢抗性,萎缩芽孢杆菌芽孢用于制作灭菌生物指示剂。至今,萎缩芽孢杆菌... 详细信息

与大部分其他类型的微生物相比,微生物芽孢通常认为对灭菌处理更有抗性。萎缩芽孢杆菌适合作为指示微生物用于检验干热、环氧乙烷、微波以及电热灭菌效果。由于其芽孢抗性,萎缩芽孢杆菌芽孢用于制作灭菌生物指示剂。至今,萎缩芽孢杆菌研究重点在于其芽孢应用,而对萎缩芽孢杆菌的检测方法严重缺少。本文对萎缩芽孢杆菌生理、生化以及分子方面全面研究,意在制定出萎缩芽孢杆菌检测方法,为萎缩芽孢杆菌的应用奠定基础。本文选择了9种芽孢杆菌进行研究,其中萎缩芽孢杆菌ATCC9372作为标准菌株,在此基础上制定萎缩芽孢杆菌检测方法。第一,对萎缩芽孢杆菌ATCC9372的表观特征进行观察,配制出一种酪氨酸培养基,萎缩芽孢杆菌ATCC9372能在其培养基上产生黑色素,而其它供试菌株不产生黑色素,选择酪氨酸培养基作为萎缩芽孢杆菌的初步鉴定手段。此外,进行API50CHB试剂条对供试菌株进行鉴定,结果萎缩芽孢杆菌未能成功鉴定。观察供试菌株对7%NaCl生长、氧化酶试验、硝酸盐还原、淀粉水解、甘油利用、明胶液化、甘露糖利用、甘露醇利用、阿拉伯糖利用以及苦杏仁苷利用实验结果,通过比较,制定萎缩芽孢杆菌ATCC9372生化谱。根据萎缩芽孢杆菌ATCC9372生理生化特征,制定萎缩芽孢杆菌生理生化鉴定方法。第二,从微生物分子方面研究萎缩芽孢杆菌ATCC9372特性,选择通用引物和RecA引物对供试菌株进行PCR实验,同时对萎缩芽孢杆菌扩增片段进行测序。结果表明,RecA引物PCR实验对萎缩芽孢杆菌鉴定具有特异性,最终确定RecA引物为特异性引物,其PCR实验作为萎缩芽孢杆菌分子鉴定方法。文中提出2种DNA提取方法。一种为水煮法,一种为DNA试剂盒提取法。同时设立一对对照组。以此,优化萎缩芽孢杆菌分子鉴定法,使得实验结果更加准确、高效。第三,对制定的萎缩芽孢杆菌检测方法进行方法验证。一方面从市场上购买了4种品牌萎缩芽孢杆菌菌片,通过制定的鉴定方法进行验证,证实4种品牌菌片内含菌均为萎缩芽孢杆菌,说明制定的萎缩芽孢杆菌鉴定方法可靠、准确;另一方面选择环境水样,检测环境水样中的萎缩芽孢杆菌,通过2种萎缩芽孢杆菌检测方法检测,得出萎缩芽孢杆菌浓度,且2种方法结果一致,方法有效、可行。第四,初步探讨利用加标回收率、精确度等相关指标对萎缩芽孢杆菌检测方法进行评价。总而言之,本文成功制定了2种萎缩芽孢杆菌检测方法。

关键词：萎缩芽孢杆菌生理生化 PCR技术检测

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萎缩芽孢杆菌SF1拮抗蛋白质的研究

萎缩芽孢杆菌SF1拮抗蛋白质的研究

作者：陈欣欣内蒙古大学

学位级别：硕士

胡麻枯萎病是由尖孢镰刀菌胡麻专化型引起的一种严重的真菌性病害。本实验室筛选获得一株萎缩芽孢杆菌SF1,能抑制尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株的生长。前期试验采用非接触平板培养法测定胞外挥发性物质具有抑菌作用;采用蛋白酶处理发酵证... 详细信息

胡麻枯萎病是由尖孢镰刀菌胡麻专化型引起的一种严重的真菌性病害。本实验室筛选获得一株萎缩芽孢杆菌SF1,能抑制尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株的生长。前期试验采用非接触平板培养法测定胞外挥发性物质具有抑菌作用;采用蛋白酶处理发酵证明胞外蛋白具有较好的抑菌活性。本论文将在此基础上对菌株SF1的有效拮抗蛋白质进行进一步研究。首先,采用体外平板实验,观察确定菌株SF1分泌的胞外物质可以抑制病原菌菌落的生长,抑菌率为48.18%,并且能有效抑制病原菌菌丝的生长和孢子萌发,导致病原菌菌丝及孢子形态畸形。其次,运用蛋白质双向电泳技术对生防菌SF 1和标准菌株萎缩芽孢杆菌CGMCC1.3383的胞外蛋白质进行了蛋白质组学水平的差异比较分析,共找到154个差异点,对其中33个差异极显著的上调蛋白进行质谱鉴定,成功鉴定出14种蛋白质：Thioredoxin-like protein ykuU(类硫氧还蛋白ykuU)、2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (2,3-二磷酸甘油酸非依赖型磷酸甘油酸变位酶)、Dihydrolipoyl dehydrogenase (二氢硫辛酸脱氢酶)、Inosine-5’-monophosphate dehydrogenase(次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶)、(3R)-hydroxymyristoyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase (β-羟脂酰ACP脱水酶)、Bifunctional protein GlmU (双功能蛋白GlmU)、Putative aminopeptidase ytoP (推定的氨基肽酶ytoP)、Probable4-aminobutyrate aminotransferase(可能的4-氨基丁酸转氨酶)、Putative aminopeptidase yhfE(推定的氨基肽酶yhfE)、Pyrrolidone -carboxylate peptidase(吡咯烷磷酸肽酶)、Beta-glucanase(β-葡聚糖酶)、Minor extracellular protease vpr(小胞外蛋白酶vpr)、Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase(甘油磷酸二酯磷酸二酯酶),这14个蛋白质点具有潜在的抗菌生防活性,有待于进一步研究分析。

关键词：萎缩芽孢杆菌胡麻枯萎病拮抗蛋白质双向电泳

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萎缩芽孢杆菌SF1拮抗蛋白生防功能研究

萎缩芽孢杆菌SF1拮抗蛋白生防功能研究

作者：郑雅心内蒙古大学

学位级别：硕士

本论文以前期实验室分离的一株生防菌萎缩芽孢杆菌SF1产生的真菌细胞壁降解酶为研究对象,通过对其异源表达获得了三种蛋白纯化物,并在宏观和微观水平分析了三种蛋白对病原菌的拮抗作用机制。本文的主要研究内容和结果如下:1.从生防菌SF... 详细信息

本论文以前期实验室分离的一株生防菌萎缩芽孢杆菌SF1产生的真菌细胞壁降解酶为研究对象,通过对其异源表达获得了三种蛋白纯化物,并在宏观和微观水平分析了三种蛋白对病原菌的拮抗作用机制。本文的主要研究内容和结果如下:1.从生防菌SF1中克隆获得了丝氨酸蛋白酶基因aprX、β-1,3-葡聚糖酶基因bglS和几丁质酶基因chiA,基因全长分别为1332 bp、1086 bp和1781 bp;成功构建重组质粒pEASY-Blunt-E1-aprX、pEASY-Blunt-E1-bglS、pEASY-Blunt-E1-chiA,并转化大肠杆菌。PCR鉴定、SDS-PAGE检测和western blot分析表明,重组菌株A2-6、B2-4及C1-4构建成功。通过对重组菌株诱导条件进行优化,丝氨酸蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活力分别达到5.77U/mL、1.70U/mL和7.93 U/mL。2.通过盐析、透析和镍柱亲和层析对重组菌株表达蛋白质进行纯化,分别获得了三种拮抗蛋白纯化物,SDS-PAGE分析表明均已达到电泳纯。3.三种蛋白单独处理病原菌,其平均抑菌率分别为30.8%、31.2%和32.5%,光学显微镜、激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)和扫描电子显微镜(SEM)镜检表明,三种拮抗蛋白均可破坏菌丝细胞壁,抑制病原菌生长,但每种酶的破坏部位和方式有区别。4.三种蛋白两两组合处理病原菌,其平均抑菌率分别为32.4%、34.8%和36.2%,光学显微镜、激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)和扫描电子显微镜(SEM)镜检表明,与单种酶作用相比抑制作用增加。5.三种蛋白混合处理病原菌,其平均抑菌率达到37.8%,光学显微镜、激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)和扫描电子显微镜(SEM)镜检表明,三种蛋白作用与单种酶作用相比抑制效果增加。

关键词：萎缩芽孢杆菌真菌细胞壁降解酶生物防治

萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)与铀、铬相互作用机理研究

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萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)与铀、铬相互作用机理研究

作者：王超西南科技大学

学位级别：硕士

微生物修复是治理核素(重金属)污染的一种廉价、高效、环境友好的方法,近些年来成为研究的热点。Ua菌株为实验室前期从铀尾矿库矿渣中分离得到,经鉴定,该菌株与对U(VI)、Cr(VI)有较强去除能力的ATCC 9372菌株同为萎缩芽孢杆菌。为了获... 详细信息

微生物修复是治理核素(重金属)污染的一种廉价、高效、环境友好的方法,近些年来成为研究的热点。Ua菌株为实验室前期从铀尾矿库矿渣中分离得到,经鉴定,该菌株与对U(VI)、Cr(VI)有较强去除能力的ATCC 9372菌株同为萎缩芽孢杆菌。为了获得微生物对U(VI)、Cr(VI)的去除效应及其相互作用机理,本研究首先考察了两株萎缩芽孢杆菌对U(VI)、Cr(VI)的耐受性及去除能力差异,然后采用转基因技术验证YtiB基因、YthA基因、Pho N基因对U(VI)、Cr(VI)的去除效应,最后结合转录组测序分析两株菌应对Cr(VI)胁迫的表达机理。主要研究结果如下:(1)通过考察萎缩芽孢杆菌ATCC 9372菌株与Ua菌株对U(VI)、Cr(VI)的耐受性及去除能力差异发现,微生物对重金属的去除能力与其的耐受性有关,同一种属的微生物对重金属的去除效应也存在较大差异。当U(VI)浓度低于80mg/L时,两株菌的去除效应基本一致;U(VI)浓度达到120mg/L时,ATCC 9372菌株对U(VI)的去除率到达93.33%,比Ua菌株高出约20%。当Cr(VI)浓度低于20mg/L时,两株菌的去除效应基本一致,当Cr(VI)浓度达到40mg/L时,两株菌的去除效应差异巨大,两株菌对U(VI)、Cr(VI)去除表现出的去除能力差异可能与Ua菌株的来源有关,也可能与微生物对不同重金属去除能力的不同有关。(2)选取对U(VI)、Cr(VI)有较好耐受性及去除能力的萎缩芽孢杆菌ATCC9372菌株为宿主菌,以pBS-E DNA为表达载体,利用穿梭表达载体的构建策略,分别将YtiB基因、YthA基因、Pho N基因导入宿主菌中,成功构建了ATCC9372-YtiB菌株、ATCC 9372-YthA菌株、ATCC 9372-PhoN菌株,为探究YtiB基因、YthA基因、Pho N基因对U(VI)、Cr(VI)的去除影响提供了研究材料。(3)以萎缩芽孢杆菌ATCC 9372菌株为对照,考察ATCC 9372-Yti B菌株、ATCC 9372-YthA菌株、ATCC 9372-PhoN菌株对U(VI)、Cr(VI)的去除效应。研究发现,ATCC 9372-YtiB菌株对120mg/L U(VI)的去除率下降了7.55%,对40mg/L Cr(VI)的去除率下降了11.95%;ATCC 9372-YthA菌株对120mg/L U(VI)的去除率下降了7.43%,对40mg/L Cr(VI)的去除率下降了23.19%;ATCC 9372-PhoN菌株对120mg/L U(VI)的去除率上升了5.11%,对40mg/L、60mg/L、80mg/L Cr(VI)的去除率分别上升了2.91%、15.03%和16.24%。初步表明YtiB基因、YthA基因对U(VI)、Cr(VI)的去除是负相关的,PhoN基因对U(VI)、Cr(VI)的去除是正相关的。(4)分别对40mg/L Cr(VI)处理的萎缩芽孢杆菌ATCC 9372菌株和Ua菌株进行转录组测序分析,发现40mg/L Cr(VI)处理后ATCC 9372菌株有197个基因出现上调,196个基因出现下调,Ua菌株有228个基因出现上调,144个基因出现下调;通过GO功能注释发现参与BP过程的基因出现较大的差异表达,这说明微生物应对重金属胁迫以调节自身的新陈代谢为主;由KEGG基因通路注释可知基因在生物体内参与复杂的代谢途径,其功能并不只由自身决定,与其参与的代谢途径也有关系。Ua菌株中的Yti B基因和YthA基因表达量分别由294个、350个降为281个、256个,出现下调,这与转基因验证结果相对应。综上所述,相似微生物对重金属的去除能力存在较大差异;经转基因和KEGG代谢途径可知,基因功能并不完全由基因本身决定,与其参与的代谢途径也有较大联系;微生物面对重金属胁迫时,其代谢活动的调节是主要的应对策略。

关键词：铀污染铬污染萎缩芽孢杆菌转录组测序 YtiB基因 YthA基因 PhoN基因