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萍乡红鲫Hira基因的克隆、表达分析及多克隆抗体制备

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萍乡红鲫Hira基因的克隆、表达分析及多克隆抗体制备

作者：王鹏南昌大学

学位级别：硕士

萍乡红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var. Pingxiangnensis)是分布在江西省萍乡地区的天然三倍体鲫突变体,经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。Hir/Hira... 详细信息

萍乡红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var. Pingxiangnensis)是分布在江西省萍乡地区的天然三倍体鲫突变体,经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。Hir/Hira基因是一种组蛋白基因表达负调节因子,其产物HIR/HIRA作为组蛋白的伴侣蛋白,广泛存在于多种生物体内发挥不同的作用。HIRA蛋白家族最显著的特点是氨基酸序列N端存在7个高度同源的WD40结构域,此结构域常介导蛋白质之间的相互作用,参与多种细胞功能的调节,在信号转导、蛋白运输、染色体修饰、转录或RNA加工、细胞凋亡等过程中具有重要作用。另据报道称Hira基因可能对鱼类精核解凝发挥重要作用。因此,本研究以萍乡红鲫为材料,对Hira基因在三倍体鱼类中基因构成及表达特征进行了初步探索,为研究该基因在生殖发育过程中的作用打下基础。主要内容如下：1.采用SMART cDNA合成和RACE-PCR等技术,克隆得到全长cDNA序列,长度为3851bp,包含一个3033bp的开放阅读框,编码1010个氨基酸。为提交和查阅序列方便,将此序列命名为*** ***-HIRA(简写为Cavp-HIRA),并提交到NCBI录入GenBank中,登录号为HM067834。另外,通过生物软件分析,发现萍乡红鲫Hira基因与银鲫Hira基因在进化分类上存在较高的同源性,并且在其推导氨基酸序列N端包含7个WD40区,因而推定萍乡红鲫HIRA属于HIRA蛋白家族。2.利用荧光定量PCR技术检测了Hira基因在萍乡红鲫心、肝、脾、肾、脑、肌肉、精巢、卵巢等组织中的表达情况,结果发现该基因在卵巢中大量表达,而在其余组织中存在少量表达或是不表达的情况,与所做的RT-PCR结果基本吻合。3.在克隆得到的序列开放阅读框内,选取了一段长550bp的保守结构域进行了蛋白原核表达,用亲和层析法纯化了表达产物,利用紫外吸收差法测定纯化蛋白浓度,并将其作为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,以便用于后期免疫荧光组织化学等实验。本研究为萍乡红鲫Hira基因在鱼类遗传发育方向的研究打下基础。

关键词：萍乡红鲫 Hira WD40 三倍体鲫鱼雌核发育荧光定量PCR

萍乡红鲫卵母细胞发育及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在其中的表达和定位

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萍乡红鲫卵母细胞发育及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在其中的表达...

作者：易伟佳南昌大学

学位级别：硕士

本文采用组织学和免疫组织化学的方法研究了萍乡红鲫早期性腺发育和丝裂原活化激酶(MAPK)在卵母细胞中的表达和定位,为鱼类性腺发育研究和养殖生产提供了理论研究,研究结果如下：萍乡红鲫早期性腺发育组织学观察表明：在早期性腺发育... 详细信息

本文采用组织学和免疫组织化学的方法研究了萍乡红鲫早期性腺发育和丝裂原活化激酶(MAPK)在卵母细胞中的表达和定位,为鱼类性腺发育研究和养殖生产提供了理论研究,研究结果如下：萍乡红鲫早期性腺发育组织学观察表明：在早期性腺发育时期过程中,原始生殖细胞(PGCs)沿着肠系膜背侧进行迁移,不断地进行增殖发育,最后聚集到生殖嵴上(靠近肠管和肾管),形成原始性腺。在出膜前期,首次观察到靠近肠系膜背侧和卵黄囊的PGC,细胞大且透亮,染色浅,卵黄囊为细胞提供营养物质,5日龄时PGCs迁移到生殖嵴上,形成原始性腺,卵黄囊被完全吸收,50日龄的稚鱼开始出现了组织学分化,原始性腺形成卵巢。萍乡红鲫卵母细胞发育形态观察结果：根据细胞的大小和形态特征、核质比大小、核仁数目、嗜酸碱性、滤泡膜的组成和变化等特征,萍乡红鲫卵母细胞可分为6个时相1-6。第1时相卵母细胞：卵原细胞成簇排列,呈圆形或卵圆形,细胞核占细胞的绝大部分;细胞大小为：15.77um～32.77um。第2时相卵母细胞：呈圆形、椭圆形和多角形的圆形,体积变大,核仁数目增多,产卵板形成,细胞呈嗜碱性,细胞大小为69.40um～119.92um。第3时相卵母细胞：呈圆形或卵圆形,出现液泡和放射带,液泡形态由小到大,数量由少到多,充满着细胞质,双层滤泡膜,呈弱嗜酸性,晚期出现卵黄颗粒,细胞大小为68.63um～372.73um。第4时相卵母细胞：卵黄颗粒逐渐充满了卵母细胞,晚期卵母颗粒数量增多且融合成块状,细胞核体积越来越小,并向动物极移动,油滴由小聚合成为大油滴,放射纹明显。细胞大小为317.2um～1003.06um。第5时相卵母细胞：细胞核消失只留下类似细胞核状的核区,核膜消失,核仁消失。这个时期的卵母细胞为成熟的卵子等待受精。大小为卵母细胞时期最大的为：1043.28um～1144.23um。第6时相卵母细胞：为退化的卵母细胞,组织学观察卵巢中有大量正在消化吸收的卵母细胞和消化后的卵母细胞,还有一些2、3、4时相的卵母细胞 MAPK免疫组织化学结果：MAPK在萍乡红鲫各个时相卵母细胞中的表达有差异,在第2时相卵母细胞中没有表达,在第3时相开始表达,最初出现在细胞质中靠近细胞膜的位置,第4时相MAPK的表达量迅速增加,并几乎充满着整个细胞质,第5时相MAPK不仅分布在细胞质中,还向核区迁移,以上结果显示MAPK是从细胞质靠近卵膜部分逐渐向细胞核处迁移,且在第3时相开始表达直到第5时相(受精结束)后消失。暗示MAPK在萍乡红鲫卵母细胞的减数分裂中起调控第一次减数分裂阻滞启动的作用。

关键词：萍乡红鲫 PGCs 卵母细胞 MAPK 免疫组化

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萍乡红鲫卵膜糖蛋白ZP3基因的克隆与表达

萍乡红鲫卵膜糖蛋白ZP3基因的克隆与表达

作者：吴会芳南昌大学

学位级别：硕士

萍乡红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus ***)是在江西省萍乡地区分布的天然三倍体鲫突变体经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。卵透明带(zona pellucida,ZP)... 详细信息

萍乡红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus ***)是在江西省萍乡地区分布的天然三倍体鲫突变体经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。卵透明带(zona pellucida,ZP),是围绕在卵外周的细胞外糖蛋白基质,ZP3是ZP家族的成员之一。实验表明,ZP3是初级精子受体,在哺乳动物中已被证实具有结合精子并引发顶体反应的功能,其O-连糖基化侧链在精子结合中起关键作用。本论文主要内容分为两部分:一、采用SMART cDNA合成和RACE-PCR技术扩增萍乡红鲫ZP3基因的cDNA序列,克隆得到的cDNA序列长度为1278bp。该序列具有完整的3′端,包含终止密码子TAA,加尾信号AATAAA以及30bp的poly(A)尾巴。其中16-1230bp为ZP3的部分开放阅读框,编码404个氨基酸残基。比较萍乡红鲫、银鲫、普通鲤鱼、彩鲫和普通鲫鱼ZP3氨基酸序列同源性,结果表面萍乡红鲫和银鲫之间的同源性最高,提示在进化中,二者的亲缘关系可能很近;二、将萍乡红鲫ZP3 cDNA核心片段克隆到表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达出ZP3融合蛋白,用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物,并通过SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测和鉴定,最后采用Bradford法对纯化的蛋白进行定量。结果得到较为纯化的ZP3融合蛋白,其分子大小约为31KDa,浓度为3.588mg/ml。为下一步ZP3抗体的制备以及进一步研究萍乡红鲫ZP3在卵子发生过程中的表达特征奠定基础。同时也为从精卵识别与早期结合的角度深入研究萍乡红鲫受精过程,探索鱼类受精过程中的精卵识别机制提供有价值的基础资料,并为其繁殖、养殖指导生产提供理论依据。

关键词：萍乡红鲫 ZP3 基因克隆表达

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萍乡红鲫消化酶活性及肠道组织学研究

萍乡红鲫消化酶活性及肠道组织学研究

作者：帅细连南昌大学

学位级别：硕士

本研究运用常规解剖学、组织学、免疫组织化学及酶学技术,对萍乡红鲫肠道大体形态、组织、细胞及消化酶活性进行了研究。结果表明:萍乡红鲫无胃,肠道紧接在食管之后,整个肠道在腹腔内呈“S”型走向。由前至后依次分前肠、中肠和后肠,前... 详细信息

本研究运用常规解剖学、组织学、免疫组织化学及酶学技术,对萍乡红鲫肠道大体形态、组织、细胞及消化酶活性进行了研究。结果表明:萍乡红鲫无胃,肠道紧接在食管之后,整个肠道在腹腔内呈“S”型走向。由前至后依次分前肠、中肠和后肠,前肠起始端膨大,肠管由前向后逐渐变细。体重(Y)随体长(X)变化的回归方程为Y=0.0309X(R=0.9531)。肠长比为3.73。各肠段肠壁包括粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层,肌层分内环行和外纵行两层。粘膜褶的高度和数目由前肠到后肠逐渐降低,前肠、中肠及后肠之间的差异均极显著(P＜0.01)。杯状细胞的数目:由前肠向后肠呈逐渐增多的趋势,经统计学分析差异不显著(P＞0.05)。肠道粘液细胞可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型。前肠以Ⅰ型粘液细胞为主,主要呈球形或杯状;中肠以Ⅳ型粘液细胞为主,细胞形态与前肠粘液细胞相似;后肠以Ⅲ型粘液细胞为主,主要呈蝌蚪状。胃泌素细胞和生长抑素细胞形态多样,有柱形、圆形、椭圆形、锥形和细长形等。胃泌素细胞和生长抑素细胞各肠段均有分布,分布密度由前肠往后肠逐渐降低。福林酚试剂法测得不同组织中蛋白酶活性大小顺序为:前肠＞中肠＞后肠＞肝胰脏,肝胰脏蛋白酶活性极显著低于肠道各段(P＜0.01),前肠蛋白酶活性极显著高于后肠(P＜0.01),显著高于中肠(P＜0.05),中肠与后肠的蛋白酶活性没有显著差异(P＞0.05)。聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法测得不同组织间脂肪酶活性大小顺序为:中肠＞肝胰脏＞前肠＞后肠,不同组织中的脂肪酶活性均没有显著差异(P＞0.05)。淀粉—碘显色法测得淀粉酶活性大小在不同组织中的顺序为:肝胰脏＞前肠＞后肠＞中肠,肝胰脏的淀粉酶活性显著高于前肠(P＜0.05),极显著高于中肠和后肠(P＜0.01),肠道各段淀粉酶活性均没有显著差异(P＞0.05)。

关键词：萍乡红鲫肠道组织学组织化学免疫组织化学消化酶

萍乡红鲫Hira基因及其启动子的特征和在卵巢周年发育中的研究

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萍乡红鲫Hira基因及其启动子的特征和在卵巢周年发育中的研究

作者：刘志鹏南昌大学

学位级别：硕士

萍乡红鲫（pingxiang red-transparent crucian carp, curassius auratus var. pingxiangnesis）,通体透明,体呈肉红色,是江西省萍乡地区分布的一种天然三倍体野生鲫鱼的突变种。在2008年被国家水产原、良种委员会审定为一个新的养殖品... 详细信息

萍乡红鲫（pingxiang red-transparent crucian carp, curassius auratus var. pingxiangnesis）,通体透明,体呈肉红色,是江西省萍乡地区分布的一种天然三倍体野生鲫鱼的突变种。在2008年被国家水产原、良种委员会审定为一个新的养殖品种。经过连续多代人工选育,得到生长速度快、适应性强、营养价值高、易养易繁、抗病力强等优良经济性状,且遗传性状基本稳定的后代。现已证实萍乡红鲫具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。在对银鲫、果蝇等一些生物的研究中,Hira基因在雌核发育中与精核解凝有关。实验从三个方面对萍乡红鲫Hira基因做了相关工作,以探讨其在萍乡红鲫生殖调控中的作用。一、实验采用RACE-PCR技术克隆得到萍乡红鲫Hira基因cDNA全长,序列全长为3851bp,开放阅读框3033bp,编码1010个氨基酸。通过氨基酸序列比对,同源分析发现Hira基因存在较大的种属特异性和稳定性。萍乡红鲫HIRA蛋白与银鲫、普通鲫鱼及斑马鱼的HIRA蛋白同源性较高,与两栖类、爬行类、鸟类以及哺乳类动物的HIRA蛋白同源关系较远。信号肽分析表明Hira基因无信号肽,推测HIRA蛋白可能为可溶性蛋白于细胞质基质或进入细胞核发挥功能,符合其作为组蛋白伴侣而行使调控基因转录的特性。二、利用Genome Walker法进行Hira基因启动子的步移,经过2次步移,测序后MEGA软件拼接得到启动子序列3.6kb。Proscan软件分析表明在Hira基因翻译起始位点ATG上游-1278bp～-1035bp段可能为基因的强启动区,含有1个TATA-BOX,1个CAATBOX,1个EBOX和一个POU1Fla,这些结构域序列可能对于Hira基因的表达,起到了重要的调控作用。三、利用荧光定量PCR方法检测了Hira基因在萍乡红鲫自出苗后至性腺成熟的成体鱼的卵巢组织中的表达变化情况。结果显示,Hira基因在卵巢组织中表达的周年内总体表现为上升趋势,出苗后1～5月龄表达量较小,在第6月龄突然增加,相对量达到3月龄时的1947倍,之后急剧减少。第7月龄～第10月龄,Hira基因的表达量相对第6月龄时表现为急剧减少趋势。第11月龄时又突然增加到全年中表达量最大值,为出苗后半月龄的3383倍,之后在第12月龄时又有减少情况。

关键词：萍乡红鲫 Hira基因荧光定量启动子克隆

萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化及酶原前体cDNA克隆、序列分析

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萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化及酶原前体cDNA克隆、序列分析

作者：花育旗南昌大学

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本研究运用亲和层析等方法对萍乡红鲫胰蛋白酶进行提取与纯化,并对酶的性质进行了研究;运用分子克隆手段获得了胰蛋白酶原前体基因,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了初步分析。主要研究结果如下：1、... 详细信息

本研究运用亲和层析等方法对萍乡红鲫胰蛋白酶进行提取与纯化,并对酶的性质进行了研究;运用分子克隆手段获得了胰蛋白酶原前体基因,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了初步分析。主要研究结果如下：1、胰蛋白酶的提取纯化利用硫酸铵分级沉淀、透析、以鸡卵粘蛋白为配基的Sepharose4B-CL亲和层析等方法,得到一种萍乡红鲫胰蛋白酶,经SDS-PAGE分析,该酶的分子量为24kDa。2、pH和温度对胰蛋白酶活性的影响以BAEE(N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯)为底物,研究得出酶的最适温度为50℃、最适pH为7.5。3、胰蛋白酶原前体基因全长cDNA序列利用分子克隆方法从萍乡红鲫中获得胰蛋白酶原前体全长cDNA为866bp,包括5'端非编码区21bp,3’非编码区107bp。4、酶原前体推导氨基酸序列的分析萍乡红鲫胰蛋白酶原前体基因开放阅读框编码246个氨基酸序列,包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的激活肽,含有保守的具有催化活性的三联体结构(His63,Asp107和Ser200)和决定底物特异性的必不可少的天冬氨酸残基(Asp194);具有12个半胱氨酸(Cys,C)残基,可形成6个二硫键。5、酶原前体基因的同源性分析由系统进化树推断,萍乡红鲫与中华倒刺鲃属于同一分支,两者同源性最高。6、酶原前体基因推导蛋白的分析及其结构预测。对由胰蛋白酶原前体cDNA推导的氨基酸序列进行分析,得到蛋白质的分子量Wm=26341.8Da,等电点pI=6.48,其氨基酸组成中丝氨酸(Ser)含量最高,占整个氨基酸数目的13.82%,其次为甘氨酸(Gly)为9.76%;二级结构预测表明该蛋白质二级结构包含四种形式(α-螺旋、延伸链、β-转角、随机卷曲)。

关键词：萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化分子克隆

不同体色萍乡红鲫皮肤组织学、黑色素浓集激素受体及细胞色素b基因的研究

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不同体色萍乡红鲫皮肤组织学、黑色素浓集激素受体及细胞色素b基...

作者：付小全南昌大学

学位级别：硕士

本研究对四种表型(全黑、半黑、花斑、全红)萍乡红鲫的鳞片及皮肤色素细胞进行了光学显微镜观察,并对其皮肤进行了组织学研究,克隆了萍乡红鲫黑色素浓集激素受体基因的部分片段,并对其在组织中的分布和表达情况进行了研究,同时克隆了萍... 详细信息

本研究对四种表型(全黑、半黑、花斑、全红)萍乡红鲫的鳞片及皮肤色素细胞进行了光学显微镜观察,并对其皮肤进行了组织学研究,克隆了萍乡红鲫黑色素浓集激素受体基因的部分片段,并对其在组织中的分布和表达情况进行了研究,同时克隆了萍乡红鲫的Cyt b基因,分析比较了萍乡红鲫在进化上的地位。主要内容如下:1.利用光学显微镜对四种表型萍乡红鲫鳞片及皮肤进行了观察,发现其鳞片都只含有三种色素细胞,即黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞;而其皮肤都只含有黑色素细胞和黄色素细胞;不同表型的萍乡红鲫鳞片和皮肤色素细胞的分布存在差异,主要表现在黑色素细胞的形态和分布上。通过常规石蜡切片技术,对全红萍乡红鲫的皮肤进行了组织学观察,发现其色素细胞不仅存在于表皮层与真皮层之间、真皮层与皮下层之间,在腺层和皮下层中也有分布;2.克隆了全红萍乡红鲫MCHR2基因编码区的部分cDNA序列,长度为366 bp,编码122个氨基酸;用荧光定量PCR检测了MCHR2基因在全红萍乡红鲫组织中的分布以及四种表型红鲫大脑和皮肤组织中的分布,结果发现MCHR2在全红萍乡红鲫肝脏中表达量最高,在肾中表达量最低,其次依次是眼、肌肉、鳃、大脑、肠和心脏;在四种表型红鲫大脑组织中,MCHR2的表达量无显著差异;而在皮肤组织中,全红表型与全黑表型的MCHR2表达量都存在显著差异,而与花斑表型及半黑表型间无显著差异。3.克隆了萍乡红鲫MCHR1a和MCHR1b基因部分cDNA序列,通过BALST比对发现,其间有96%的同源性;利用RT-PCR技术检测发现MCHR1a和MCHR1b在组织中的分布和表达量基本一致,因此,认为萍乡红鲫MCHR1a和MCHR1b基因是同一个基因,改名为MCHR1,即萍乡红鲫MCHR1基因并未发生分化,经拼接获得了其编码区的部分cDNA序列,长度为481 bp,编码160个氨基酸;4.克隆了四种表型红鲫线粒体细胞色素b基因完整编码区,发现其序列完全一致,长度为1 140 bp,编码380个氨基酸。表明萍乡红鲫群体尽管部分个体在表型上存在差异,但并没有在分子水平上发生改变,没有形成亚种。运用邻接法构建的分子系统树表明萍乡红鲫与普通鲫鱼亲缘关系最近。

关键词：萍乡红鲫 MCHR1 MCHR2 Cyt b 荧光定量PCR