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菌落杂交法鉴定沙门菌第一类整合子

中国卫生检验杂志 2007年第1期17卷 49-50页

作者：张宏梅石磊李琳广东工业大学轻工化工学院广州510006 华南理工大学轻工与食品学院广州510640

目的:建立一种快速而经济的鉴定细菌中整合子的新方法,分析整合子介导的细菌耐药性。方法:以第一类整合酶基因intI1为探针,采用地高辛进行标记,菌落杂交的方法来鉴定第一类整合子阳性菌株。结果:发现在23株沙门菌中,四株第一类整合子阳... 详细信息

目的:建立一种快速而经济的鉴定细菌中整合子的新方法,分析整合子介导的细菌耐药性。方法:以第一类整合酶基因intI1为探针,采用地高辛进行标记,菌落杂交的方法来鉴定第一类整合子阳性菌株。结果:发现在23株沙门菌中,四株第一类整合子阳性菌株,与采用第一类整合酶基因intI1 PCR扩增方法所得到的结果相一致。结论:菌落杂交法可以简单快速地鉴定细菌中整合子,这对研究整合子的特性及整合子在细菌耐药性中的介导作用具有重要意义。

关键词：整合子整合酶菌落杂交

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致病性副溶血性弧菌菌落杂交检测体系的优化

微生物学杂志 2018年第3期38卷 23-28页

作者：徐马俊坤冯博张昭寰孙晓红潘迎捷赵勇上海海洋大学食品学院上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海) 上海201306

对常见食源性致病菌副溶血性弧菌的杂交条件进行了优化。基于副溶血性弧菌的tdh,trh,toxR基因选用了3种探针序列,从菌落杂交样品的预处理方法、杂交时间和显色检测等方面对基于副溶血性弧菌毒力基因的原位杂交实验进行了条件优化。结果... 详细信息

对常见食源性致病菌副溶血性弧菌的杂交条件进行了优化。基于副溶血性弧菌的tdh,trh,toxR基因选用了3种探针序列,从菌落杂交样品的预处理方法、杂交时间和显色检测等方面对基于副溶血性弧菌毒力基因的原位杂交实验进行了条件优化。结果表明,采用80℃热固定2 h,37℃预杂交10 min后杂交8 h以及封闭1 h的改良方法可获得高特异性、低背景且着色清晰的实验结果。优化的菌落杂交技术检测副溶血性弧菌与传统检测方法相比,具有高效、准确、可区分致病性菌株的优点,为水产品中副溶血性弧菌致病菌株和非致病菌株的同步检测和筛选提供参考。

关键词：致病株副溶血性弧菌原位杂交菌落杂交

东乡野生稻NBS-LRR类抗性基因同源序列的分离与鉴定

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国防科技大学学报 2008年第2期30卷 56-60页

作者：王正华杲修杰曹孟良国防科技大学计算机学院湖南长沙410073 国家杂交水稻工程技术研究中心湖南长沙410125

基于植物的抗性基因具有保守序列,根据已克隆基因的保守序列设计探针,利用菌落杂交的方法,对东乡野生稻大片段基因组文库进行筛选,得到两个候选克隆。序列比对发现其中含有NB-ARC的保守序列,可用于后续转基因鉴定。

关键词： NBS-LRR 抗性基因菌落杂交基因组文库

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牙鲆微卫星标记的筛选及群体多态性分析

中国水产科学 2005年第6期12卷 16-21页

作者：陈微张全启于海洋胡景杰齐洁包振民中国海洋大学生命科学与技术学部海洋生物遗传与种质工程研究室中国海洋大学生命科学与技术学部海洋生物遗传与种质工程研究室山东青岛266003

以牙鲆(Paralichthys olivaceusTemminck et Schlegel)为材料,基因组DNA经Sau3AⅠ进行部分酶切后,选取400~1 200 bp大小的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC19质粒中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,构建牙鲆酶切片段基因组文库。采用菌落杂交的... 详细信息

以牙鲆(Paralichthys olivaceusTemminck et Schlegel)为材料,基因组DNA经Sau3AⅠ进行部分酶切后,选取400~1 200 bp大小的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC19质粒中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,构建牙鲆酶切片段基因组文库。采用菌落杂交的方法,以(AC)10(、AG)10为探针从文库中筛选阳性克隆16个,共得到20个微卫星序列,其中完全型13个,不完全型5个,复合型2个。对其中18个进行引物设计,有11对引物扩增出目的片段,其中8对引物在群体中具有扩增多态性。在威海野生牙鲆30个个体中,各座位上得到的等位基因数为4~19个,观测杂合度(Ho)为0.413 8~0.965 5。其中有3对引物扩增的等位基因数超过17个,表现出高度多态性。本研究旨为进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等提供基础依据。

关键词：牙鲆菌落杂交微卫星多态性

混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响

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上海海洋大学学报 2017年第5期26卷 776-783页

作者：徐马俊坤冯博张昭寰孙晓红潘迎捷赵勇上海海洋大学食品学院上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室上海201306

以9∶1和1∶1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC 33847:tdh+/trh-/tlh+;ATCC 17802:tdh-/trh+/tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2:tdh-/trh-/tlh+;G8:tdh-/trh-/tlh+)在TSB培养基和熟虾中分别进行了混合和37℃10 h的混合培养,通过菌落原位杂交技术和PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。结果显示,在TSB和熟虾中,致病菌比例均出现了下降。在熟虾样品中致病菌株下降的比例更高,其中ATCC17802和G8在熟虾样品中以9∶1比例混合并混合培养10 h后,致病菌比例从90%降为0。表明混合培养对致病性副溶血性弧菌菌株生长产生不利的影响,是造成水产样品中副溶血性弧菌感染频发却很难分离到致病性菌株的原因之一。

关键词：副溶血性弧菌致病性原位杂交菌落杂交

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东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

中国实验动物学报 2012年第3期20卷 50-55页

作者：汤敏倪丽菊高骏肖君华胡建华高诚东华大学上海201620 上海市实验动物质量监督检验站上海201203 上海实验动物研究中心上海201203 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

目的从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂... 详细信息

目的从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。结论成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究。

关键词：东方田鼠 BAC文库微卫星菌落杂交链霉亲和素磁珠

慢性消化疾病患者肠黏膜屏障功能障碍的测定及其与肠道微生态失衡的关系

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慢性消化疾病患者肠黏膜屏障功能障碍的测定及其与肠道微生态失衡...

作者：姚玉川第一军医大学

学位级别：硕士

背景及目的肠粘膜屏障功能衰竭(Intestinal barrier failure, IBF)是一种临床常见的继发综合症，可由各种外科情况诱发，表现为可分布于全身各处的肠源败血症;也可由胰腺炎、肝硬化、恶性肿瘤等慢性消耗性疾病和放化疗等干预行为... 详细信息

背景及目的肠粘膜屏障功能衰竭(Intestinal barrier failure, IBF)是一种临床常见的继发综合症，可由各种外科情况诱发，表现为可分布于全身各处的肠源败血症;也可由胰腺炎、肝硬化、恶性肿瘤等慢性消耗性疾病和放化疗等干预行为引起，表现为原发性腹膜炎或身体其他器官的肠源细菌感染。所以IBF是多器官衰竭的诱因和衰竭器官之一。肠粘膜屏障功能衰竭是肠道微生态改变和肠内炎性物质相互作用的后果，可造成肠壁的通透性增加，导致肠道细菌或其毒性代谢产物向肠外的易位(Translocation)。故IBF主要表现为肠道通透性增加和肠道微生态失衡。由于临床上缺乏简便、客观、准确、可靠的检测方法，肠道微生态失衡与肠黏膜屏障功能障碍的关系尚不能明确。本研究旨在应用独特的肠黏膜通透性及肠道微生态检测方法初步探讨肠道微生态失衡与肠粘膜屏障功能障碍二者之间的关系。 1.气相色谱法检测消化道肿瘤患者尿中乳果糖/甘露醇比值，与健康人尿样进行比较。Fe(SCN)3一CHC13二相系统光度法检测慢性消化疾病患者尿中的低分子量聚乙二醇(PEG600)含量，与其他消化道疾病患者进行比较，评价肠粘膜通透性的改变。对上述两种方法进行比较，探讨后者是否有价值作为一种简便、客观、准确的肠薪膜通透性检测方法，以在临床和科研中加以推广。 2.测定慢性消化疾病患者的肠道通透性，并进行大便菌群分析，探讨两者之间的关系。 3.制备双歧杆菌属和部分种的地高辛标记1 65 rDNA寡核昔酸探针，初步应用于微生态制剂鉴定和临床肠道微生态检测，评价寡核昔酸探针杂交在肠道微生态研究和检测中的应用价值。结果 1.气相色谱法测定尿中乳果糖/甘露醇比值(Lactu10Se八以洲妞。1， L乃以):对消化道肿瘤患者肠道通透性的测定结果显示，消化道肿瘤患者组L/M(0.0205士0.0037卜g)明显高于对照组(0.0064士0.0021林g)差异有显著性意义(p0 .05)。 3.地高辛标记寡核营酸探针具有较好的特异性与灵敏度:地高辛标记的双歧杆菌属和种的共6种寡核昔酸基因探针与标准菌株杂交后灵敏度和特异度分别为属探针95%、75%，青春双歧87.5%、9既，两歧双歧87.5%、 87.5%，短双歧87.5%、92.5%，婴儿双歧75%、95%，长双歧75%、100%。初步结果可用于微生态制剂鉴定和肠道微生态研究。 3 结论 1.肝硬化腹水、肝癌、胃肠道晚期肿瘤等慢性消化疾病患者肠道通透性增高，伴肠道微生态失衡比例增加，但可能由于例数所限，菌群紊乱与肠道通透性的正相关关系未获统计学证实。 ***(SCN)，一CHCI。二相系统光度法测定尿样中低分子量聚乙二醇 (PEG6OO)含量简便、客观，便宜，有希望作为一种可靠的IBF检测方法在临床及科研工作中加以推广。 3.寡核普酸基因探针用于肠道细菌的鉴定显示出一定前景，加大探针的种类与扩大调查范围有可能使该技术替代现有细菌培养技术。

关键词：肠粘膜屏障功能肠薪膜通透性肠道微生态菌群紊乱慢性消化道疾病 Fe(SCN)3-CHC13二相系统光度法双歧杆菌菌落杂交基因探针 16S rDNA 聚乙二醇

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假单胞菌YS1基因组BAC文库的构建

假单胞菌YS1基因组BAC文库的构建

作者：顾少菊华南热带农业大学

学位级别：硕士

为了克隆Pseudomonas pseudoalkaligenus YS1的聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)合成酶基因以及其相应的调节基因，构建Pseudomonas pseudoalkaligenus YS1的BAC (Bacterical Artificial Chromosome，BAC)文库。选择pBeloBAC11载体和E. coli DH10B宿主来构建假单胞菌YS1文库。由脉冲电泳得到部分酶切的大片段DNA，与经过纯化、去磷酸化后的载体DNA连接，电转化进入感受态的宿主细胞中。转化后的细胞在含有IPTG、X-gal和氯霉素的平板上培养，筛选阳性克隆子。挑取白斑菌落，平板保存。抽提转化子质粒，用NotI酶切检测外源片段的大小。电泳分离结果得到两个DNA片段，一个是7.5 kb的载体DNA片段，一个是大于23 kb的外源DNA片段。由于外源片段的大小与质粒总DNA电泳位置相似，为了进一步验证外源片段的正确性，采用菌落杂交来检测。杂交结果显示文库中95％以上有杂交信号，而且阴性对照无杂交信号。结果证明了克隆子中插入了正确的外源片段。文库为1000个克隆子，文库的覆盖倍数大于4.8倍。利用RAPD方法从随机引物筛选用于目的基因克隆的探针，发现有两个引物编码的氨基酸排列与10个PHAs合成酶的保守序列相同或非常相似。拟采用其扩增的特异片段为探针，或以该引物为探针。

关键词：假单胞菌YS1菌株 BAC文库脉冲电泳菌落杂交 RAPD

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东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

作者：汤敏东华大学

学位级别：硕士

本文就是应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记以用于后续的定位研究。首先,以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个... 详细信息

本文就是应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记以用于后续的定位研究。首先,以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。

关键词：东方田鼠 BAC文库微卫星菌落杂交链霉亲和素磁珠