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鹿坏死梭杆菌分离菌株保存试验

特产研究 1998年第2期20卷 34-36页

作者：王克坚陈立志刘晓颖程世鹏中国农业科学院特产研究所吉林132109

厌氧血液琼脂培养基培养的鹿坏死梭杆菌培养物加入脱纤维羊血或兔血，于－20℃下保存可存活3～4个月；于－70℃下保存，可存活2年以上。同样条件下，用含酵母的Eugonbroth培养基直接保存其鹿坏死梭杆菌培养物，也可存活2年；因此，－70... 详细信息

厌氧血液琼脂培养基培养的鹿坏死梭杆菌培养物加入脱纤维羊血或兔血，于－20℃下保存可存活3～4个月；于－70℃下保存，可存活2年以上。同样条件下，用含酵母的Eugonbroth培养基直接保存其鹿坏死梭杆菌培养物，也可存活2年；因此，－70℃下保存鹿坏死梭杆菌菌株是实验室最方便的长期保存方法。并测得Eugonbroth保存的菌株于－20℃下保存可存活2～3个月；在厌氧罐中于4℃下可存活15～30天；室温条件下存活7天。冻干保存菌种可在3年以上。

关键词：坏死梭杆菌保存菌株分离

降解亚硝酸盐菌株Bacillus velezensis GXMZU-B1的筛选、条件优化及初步应用

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南方水产科学 2024年第4期20卷 133-143页

作者：刘睿梁颖殷豆豆宋超东莫祖琴肖骏峰易晗张红岩张彬申乃坤广西民族大学海洋与生物技术学院/广西多糖材料与改性重点实验室广西南宁530006 广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室广西南宁530021

为解决高密度养殖引起的亚硝酸盐危害,筛选高效降解菌。从防城港虾塘采集水体和淤泥样品,先通过亚甲基蓝、碳酸钙平板初筛及亚硝酸盐降解效果复筛,选出降解效果最优的菌株,并进行生理生化及16S rRNA鉴定;进一步对菌株降解亚硝酸盐的温... 详细信息

为解决高密度养殖引起的亚硝酸盐危害,筛选高效降解菌。从防城港虾塘采集水体和淤泥样品,先通过亚甲基蓝、碳酸钙平板初筛及亚硝酸盐降解效果复筛,选出降解效果最优的菌株,并进行生理生化及16S rRNA鉴定;进一步对菌株降解亚硝酸盐的温度、初始pH及无机盐等条件进行优化,最后对该菌株的安全性及其处理养殖高浓度亚硝酸盐尾水的能力进行了研究。结果表明,从初筛的53株菌中复筛得到1株对0.5 g·L^(-1)亚硝酸盐降解效率可达98%的菌株,并将其鉴定命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis GXMZU-B1);该菌株降解亚硝酸盐的最优条件为:温度30℃、pH 6~7、无需添加无机盐,接种发酵12 h对0.5 g·L^(-1)亚硝酸盐的降解可达98%以上;该菌株24 h可将养殖尾水中(28.73±1.08)mg·L^(-1)的亚硝酸盐几乎完全降解。菌株的安全性试验表明,该菌株不产生溶血圈,对常见抗生素敏感。综上所述,菌株*** GXMZU-B1具有高效降解亚硝酸盐的能力,且对环境安全,为高密度工厂化养殖中亚硝酸盐的积累问题提供了新的解决思路。

关键词：亚硝酸盐贝莱斯芽孢杆菌菌株分离水产养殖养殖尾水

原料乳中产β-内酰胺酶菌株的快速筛选和鉴定

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食品科学 2013年第7期34卷 162-165页

作者：谢鲲昊满朝新卢雁刘珊珊房玉国杨士芹董馨悦姜毓君东北农业大学国家乳业工程技术研究中心黑龙江哈尔滨150030 东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室黑龙江哈尔滨150086

利用青霉素-藤黄微球菌-TSA培养基建立一种快速筛选原料乳中产β-内酰胺酶细菌的方法,该筛选方法比常规方法更加便捷,易于观察,并且具有很高的特异性分离鉴别能力,同时通过细菌16S rDNA序列比对方法来鉴定所分离的产酶菌的种属。结果表... 详细信息

利用青霉素-藤黄微球菌-TSA培养基建立一种快速筛选原料乳中产β-内酰胺酶细菌的方法,该筛选方法比常规方法更加便捷,易于观察,并且具有很高的特异性分离鉴别能力,同时通过细菌16S rDNA序列比对方法来鉴定所分离的产酶菌的种属。结果表明,原料乳中存在产β-内酰胺酶的菌株,主要产酶菌为大肠杆菌。

关键词： β-内酰胺酶原料乳菌株分离菌株鉴定

人肠道厌氧细菌菌株Eggerthella ***-Julong365对黄豆苷原的转化研究

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河北农业大学学报 2013年第3期36卷 61-65,71页

作者：李慧周博王秀伶河北农业大学生命科学学院河北保定071001

从人粪样中分离得到1株对黄豆苷原具有转化作用的革兰氏阴性严格厌氧细菌菌株,将其命名为菌株AUH-Julong365。通过与标准品对比高效液相保留时间和紫外吸收图谱,结合质谱和核磁共振氢谱等分析结果,将菌株AUH-Julong365转化大豆异黄酮黄... 详细信息

从人粪样中分离得到1株对黄豆苷原具有转化作用的革兰氏阴性严格厌氧细菌菌株,将其命名为菌株AUH-Julong365。通过与标准品对比高效液相保留时间和紫外吸收图谱,结合质谱和核磁共振氢谱等分析结果,将菌株AUH-Julong365转化大豆异黄酮黄豆苷原后的产物鉴定为雌马酚。通过手性柱检测及旋光度测定,发现该菌株转化底物黄豆苷原后生成的雌马酚为100%S-雌马酚。此外,该菌株能有效转化黄豆苷原的最大浓度为0.6mmol/L。经BLAST比对,菌株AUH-Julong365 16SrDNA序列与爱格士菌属菌株Eggerthella lenta ATCC25559相似性最高,相似性为98.6%。因此,根据16SrDNA序列分析结果,结合菌体形态及生长特性等,将菌株AUH-Julong365鉴定为Eggerthella属的一个新分类单元。

关键词： S-雌马酚黄豆苷原菌株分离微生物转化

对鞘翅目害虫有活性Bt菌株的筛选及cry8Ea2基因的克隆、表达和活性研究

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对鞘翅目害虫有活性Bt菌株的筛选及cry8Ea2基因的克隆、表达和活...

作者：刘兴龙河北农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来,鞘翅目害虫... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来,鞘翅目害虫尤其是金龟甲科害虫的危害日趋严重,由于其幼虫生活在土壤中,给防治带来很大的困难,本研究从山东省土壤中分离Bt菌株,结合本室保存的菌株,利用PCR-RFLP鉴定体系对其进行基因型鉴定,在此基础上分离克隆对金龟甲科害虫有效的新型杀虫蛋白基因,研究该基因的表达和杀虫活性,为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供新型基因资源。本研究的主要内容和结果如下: 1本试验从山东省各地采集土样750份,采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法从中分离出Bt菌57株,Bt菌株的平均分出率为7.60%,这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、方形、圆形和不规则形等形状。 2利用已设计的保守区通用引物S5un8/S3un8和S5un3/S3un3对本试验分离的和本室保存的菌株进行PCR扩增,对所鉴定的菌株中B-DLL和B-JJX菌株扩增出阳性片段,说明B-DLL和B-JJX菌株中含有cry8类基因,SDS-PAGE分析表明B-DLL和B-JJX菌株的杀虫晶体蛋白主要为130 kD。 3杀虫活性测定结果表明菌株B-DLL在浓度为6.0×10 cfu/mL时对暗黑鳃金龟和琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为26.67%、33.33%;对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为33.33%;菌株B-JJX在浓度为6.0×10 cfu/mL时对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为30.80%,对其它几种试虫没有活性。 4以菌株B-DLL质粒为模板,对GenBank中公布的cry8类基因进行分析,设计了一对cry8类特异性引物JJX5和JJX3,PCR扩增出3.5 kb的目的片段,将其克隆到载体pBluescriptSK(+),经测序分析表明,该基因的编码框由3495个碱基组成,编码的蛋白质由1164个氨基酸残基组成。通过比较,该基因编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性最高达99.31%,其中在第452、526、527、537、542、752、907和975位等8个氨基酸不同。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(Accession number:EU047597),提交国际Bt-δ-内毒素命名委员会并被确认为一个新的杀虫蛋白基因,正式命名为cry8Ea2。 5将cry8Ea2基因插入到大肠杆菌表达载体pET-21b(+)中,构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry8Ea,再将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kD的蛋白。 6 Cry8Ea2表达产物杀虫活性测定结果表明,该蛋白对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲等幼虫具有杀虫活性,在浓度为8.98μg/g土时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为46.67%、55.56%;在浓度为89.8μg/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96小时的校正死亡率为33.33%。而对华北大黑鳃金龟、茄二十八星瓢虫、黄粉虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、粘虫、粉纹夜蛾等幼虫均未发现有活性。

关键词： Bt 菌株分离 cry8Ea2基因基因克隆鞘翅目害虫杀虫活性

高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

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高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

作者：白雪峰青岛农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种具有高度特异性，对环境友好的微生物杀虫剂，其cry基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东省土壤中分离Bt菌株，然后通过生物测定筛选对鳞翅目夜蛾科昆虫具有高毒... 详细信息

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种具有高度特异性，对环境友好的微生物杀虫剂，其cry基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东省土壤中分离Bt菌株，然后通过生物测定筛选对鳞翅目夜蛾科昆虫具有高毒力的菌株，并对筛选出的高毒力菌株的蛋白组成和杀虫蛋白基因型作相应的研究，在此基础上，分离克隆新型的Bt的cry基因，研究该基因的表达和杀虫活性。本试验主要结果如下： 1采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法，从山东省采集的750份土样中分离出Bt菌株57株，Bt菌株的平均分出率为7.6％。这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、圆形等形状。 2以粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫进行高毒力菌株的初筛，菌液浓度为6.0×10cfu／mL时，对粘虫初孵幼虫校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、QCY-3、QJN-1、WRC-1、WZ-1;对甜菜夜蛾初孵幼虫校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、WRC-1、HJY-1。对Bt菌株不同成分生物测定，试验结果表明菌株QCL-1对几种夜蛾科害虫的毒力主要来自于芽孢和晶体混合物，菌株QCL-1对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力显著高于标准菌株HD-1，对粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫的毒力与标准菌株HD-1相当。 3 SDS-PAGE分析菌株QCL-1杀虫晶体蛋白主要为130kDa和70kDa两种，利用cry基因的PCR-RFLP方法鉴定菌株QCL-1中含有cry1Cb、cry1Fa、cry1Fb、cry2Ab和未知的cry2A类基因。 4以菌株QCL-1质粒为模板，利用设计的cry2A类特异性引物FY2A5和FY2A3，PCR扩增出1.9kb的目的片段，将其克隆到表达载体pET-21b(+)，构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。序列分析表明，该基因的编码框由1872个碱基组成，该基因编码的蛋白质由623个氨基酸组成，其中亲水性氨基酸占38.35％，疏水性氨基酸占45.26％，酸性氨基酸占6.90％，碱性氨基酸占9.48％。蛋白质的分子量为69.7kDa，等电点为8.825，为弱碱性蛋白质。该基因编码的氨基酸序列与已公布的Cry2Ac蛋白的氨基酸序列均不同，氨基酸序列同源性在97.4％～99.7％之间。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(GenBank accession EF405952)，并被Bt基因国际命名委员会确认为一个新的cry2Ac基因，正式命名为cry2Ac10。 5将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白。Cry2Ac10蛋白生测结果表明，该蛋白对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫具有高毒力，同时对甜菜夜蛾初孵幼虫生长有抑制作用，其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC分别为30.0μg／g和16.7μg／g。

关键词：苏云金芽孢杆菌菌株分离杀虫晶体蛋白 cry2Ac基因蛋白表达生物活性

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猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定

猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定

作者：余恩超江西农业大学

学位级别：硕士

本研究通过对健康成年猪肠道内生菌群的分离,利用点种法筛选出对临床分离的致病性大肠杆菌有明显抑制作用的肠道活性菌株作为研究对象,通过排除酸、过氧化氢试验、酶解试验来初步确定活性菌株所产抑菌活性产物为多肽或蛋白类物质。通过... 详细信息

本研究通过对健康成年猪肠道内生菌群的分离,利用点种法筛选出对临床分离的致病性大肠杆菌有明显抑制作用的肠道活性菌株作为研究对象,通过排除酸、过氧化氢试验、酶解试验来初步确定活性菌株所产抑菌活性产物为多肽或蛋白类物质。通过对活性菌株盲肠2号菌菌落形态、代谢试验及16S r DNA的检测,鉴定其为枯草芽孢杆菌。通过对活性菌株盲肠2号菌生产活性产物时的接种量、初始p H、培养温度、发酵时间、培养基组成的研究,确定了该菌株生产活性物质的最佳条件,为今后进一步开发和利用该活性菌株奠定了基础。主要内容包括以下三个部分:1.猪肠道内生菌群活性菌株的分离。从健康成年猪肠道不同区段(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠)的菌群中进行肠道内生菌株的分离和培养,分离得到形态特征尽可能不同的菌落共计2317株,以临床分离的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)作为指示菌,点种法对峙培养,将对指示菌具有明显抑菌作用的肠道内生菌株进行分离纯化,作为候选活性菌株。利用牛津杯琼脂扩散法对这些候选活性菌株的发酵上清液的抑菌活性进行检测,排除产酸、过氧化氢的可能后,再进行胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解处理,将酶解后发酵上清抑菌活性明显降低或完全丧失的菌株推定为产蛋白质类抑菌物质的活性菌株,留作进行后续研究。2.活性菌株的鉴定。以活性菌株盲肠2号菌的菌落特征、革兰氏染色,以及各种代谢反应试验结果为依据,初步确定盲肠2号菌株为芽孢杆菌(Bacillus)。进一步通过对盲肠2号菌的16S r DNA测序结果:盲肠2号菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源性达到99%以上,鉴定本试验筛选所得盲肠2号菌为枯草芽孢杆菌。3.盲肠2号菌株生产活性产物时的最佳生产条件研究。通过研究不同接种量、初始p H、培养温度、发酵时间、培养基组成对活性菌株盲肠2号菌生产活性产物的影响,结果表明该菌株在利用PCA肉汤,接种量为3%、初始p H为7.0、培养温度为37℃、发酵时间为6h时生产活性物质的抑菌活性最强。

关键词：肠道抗病菌细菌素菌株分离发酵条件优化

伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

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伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

作者：张春珍沈阳农业大学

学位级别：硕士

在昆虫病原线虫中寄生的共生菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌;其中与异小杆线虫科(Heterothabditidae)共生的发光杆菌(Phothrabdus),与斯氏线虫科(Steinernematidae)共生的致病杆菌(Xenohrabdus),是共生菌中仅有的的两类菌,他们寄生于3期侵染线虫的肠道内,随着寄主线虫一同进入到昆虫体内,并被释放到昆虫的血腔中,通过释放一系列的对昆虫有抑制分解作用的代谢产物,来杀死昆虫,为共生菌本身和线虫的生长发育和繁殖提供了充足的养分和养料。由于具有广泛的杀虫和抑菌效果,携带共生菌的线虫和线虫-共生菌复合体已经成为具有高效生物活性的新型的生物制剂,在农业上病虫害的生物防治中发挥着重要作用。特别是其中起到关键致病作用的共生菌,能够在发酵过程中合成和分泌多种具有高效抑菌活性和调节作用的代谢产物,对其进行分离纯化及结构鉴定在农业领域具有巨大的挖掘潜力,也将为新生物农药的研发奠定基础。本实验针对共生菌的主要研究方法和结果如下:1.共生菌菌株的分离纯化:本文通过对辽宁省内(抚顺市,丹东市凤城,铁岭市龙首山,铁岭市西丰等)以及省外周边(内蒙古牙克石市博克图,呼伦贝尔市扎兰屯;吉林省白山市长白山等)部分地区的土样进行采集,共得到102个土样;采用white-trap法分离获得了 38株初生型和4株次生型菌株,共计42株。2.目标菌株的筛选:对分离纯化得到的42株共生菌进行小发酵,用大孔树脂吸附法获取共生菌的粗提物。采用TLC检测技术对菌株发酵粗提物进行分析检测,结果表明SN231具有不同于其他所有粗提物的组分。分别采用菌丝生长速率法和菌块移置法测定候选菌株及其粗提物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,SN231菌株及其发酵粗提物均对辣椒疫霉病菌有一定的抑制作用。所以选定其为目标菌株,列入实验室的菌种库给予新的命名SN269,进行下一步实验。***269菌株的鉴定:对SN269菌株进行16SrRNA序列分析。PCR扩增SN269菌株的16S rRNA序列,选择同源序列进行Clustal比对,采用Mega 6.0软件构建系统发育树,结果显示SN269菌株与Xenorhabdus bovienii聚在一起,同源性为100%,所以SN269 菌株属于 Xenorhabdus bovienii,命名为Xenorhabdus bovieniiSN269。***269菌株次生代谢产物分离纯化:对SN269菌株进行液体发酵得到粗提物。然后利用柱层析技术与半制备高效液色谱技术相结合的方法对SN269菌株的次生代谢产物进行分离纯化,获得目标化合物D3。5.D3化合物的结构鉴定及活性研究:经核磁共振波谱及高分辨质谱分析,并结合相关文献,将D3鉴定为madumycin Ⅱ,是Streptogramin中具有高效抑菌活性的抗生素。通过菌丝生长速率法和微量肉汤稀释法测定化合物D3的抑真菌及细菌活性,结果表明化合物D3对辣椒疫霉和番茄灰霉的抑制效果尤为突出(EC50值分别为35.32和35.40μg/mL),并且对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果IC50值为分别为0.13±0.02μg/mL。

关键词：伯氏致病杆菌菌株分离次生代谢产物分离纯化结构鉴定抑菌作用

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污泥中氧化亚铁硫杆菌的分离及其应用效果

环境科学 2003年第3期24卷 56-60页

作者：周顺桂王世梅余素萍周立祥南京农业大学资源与环境学院南京210095

以FeSO4 ·7H2 O为能源物质 ,采用 9K选择性培养基培养继以Leathen固体培养基平板接种法直接从污泥中分离出一株高度嗜酸的氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillusferrooxidans)菌株 .该菌株适应污泥环境速度快 ,易于驯化 .序批式试验法研究表明 ... 详细信息

以FeSO4 ·7H2 O为能源物质 ,采用 9K选择性培养基培养继以Leathen固体培养基平板接种法直接从污泥中分离出一株高度嗜酸的氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillusferrooxidans)菌株 .该菌株适应污泥环境速度快 ,易于驯化 .序批式试验法研究表明 ,接种该菌株进行污泥生物淋滤可有效溶出污水污泥中重金属 .经过 4～ 1 0d的生物淋滤 ,Cr、Cu、Zn的最高去除率可分别达到 80 %、1 0 0 %和 1 0 0 % .

关键词：污泥氧化亚铁硫杆菌菌株分离生物淋滤重金属污染