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NBS型菊花白色锈病抗病相关基因克隆与表达分析

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NBS型菊花白色锈病抗病相关基因克隆与表达分析

作者：姜琳沈阳农业大学

学位级别：硕士

菊花（Chrysanthemum morifolium）姿态曼妙,风韵极佳,是世界上重要的观赏花卉。菊花白色锈病是一种具有极具破坏性的病害,严重影响了植物的观赏价值和商业价值。目前,在基因组水平上对感病菊花品种进行性状改良,是防治病害、降低损失... 详细信息

菊花（Chrysanthemum morifolium）姿态曼妙,风韵极佳,是世界上重要的观赏花卉。菊花白色锈病是一种具有极具破坏性的病害,严重影响了植物的观赏价值和商业价值。目前,在基因组水平上对感病菊花品种进行性状改良,是防治病害、降低损失最直接有效的方法。本试验以观察多年的菊花白色锈病高抗品种‘C029’和感病品种‘S13’、‘S8’、‘神马’为试验材料,利用其他与抗锈病相关物种的NBS保守结构域序列在菊花参考数据库中进行BLAST搜索,找到了候选基因CHR00059759和CHR00088030。根据基因序列设计引物进行克隆及生物信息学分析,并进一步对抗病、感病品种进行菊花白色锈病病原菌接种处理,探究NBS型抗病相关基因的特异性。主要研究结果如下:***00059759基因在抗病品种‘C029’和感病品种‘S13’、‘S8’、‘神马’中的编码序列和基因组序列分别为1612bp、1618bp、1615bp和1615bp,表明该基因不含有内含子。CHR00088030基因在抗病品种‘C029’和感病品种‘S13’、‘S8’、‘神马’中的编码序列分别为1503bp、1503bp、1497bp和1482bp。将两个基因的编码序列与NCBI保守域数据库进行序列比对,发现它们均属于RX-CC＿like超家族,且含有NB-ARC保守结构域。将CHR00059759及CHR00088030基因分别命名为CmCC-NB-ARC-1和CmCC-NB-ARC-2。2.在NB-ARC保守结构域内,CmCC-NB-ARC-1基因在抗病品种和三个感病品种中共有7个共有的差异SNP位点,导致了5个氨基酸发生非同义突变。CmCC-NB-ARC-2基因在抗病品种和三个感病品种中共有30个共有的差异SNP位点,导致了3个氨基酸发生非同义突变。由此推测这两个基因可能与菊花白色锈病抗性相关。***-NB-ARC-1及CmCC-NB-ARC-2蛋白均属于non-TIR-NBS-LRR类蛋白家族,为稳定的亲水性蛋白,不含有跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测其在叶绿体或细胞外起作用,与莴苣的亲缘关系最近。4.对抗病、感病材料进行接种菊花白色锈病病原菌处理,发现CmCC-NB-ARC-1基因在抗、感品种中虽然都呈现出先下调后呈明显的上调的表达趋势,但在抗病品种和感病品种之间的表达丰度明显不同。在抗病品种C029’中的表达水平要显著高于感病品种‘S8’,而经无菌水处理的对照组表达量均无明显变化,进一步推测CmCC-NB-ARC-1基因可能与菊花白色锈病抗性相关。

关键词：菊花 NB-ARC 菊花白色锈病克隆表达分析

菊花CmTGAs基因抗菊花白色锈病的功能鉴定

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菊花CmTGAs基因抗菊花白色锈病的功能鉴定

作者：张新沈阳农业大学

学位级别：硕士

菊花白色锈病(Chrysanthemum White Rust,CWR)是菊花首要病害之一,在菊花生长过程中影响其产量与品质,严重时导致菊花死亡。挖掘菊花抗白色锈病的基因,探索其抗病的分子机理,通过转基因育种,培育菊花优良抗病新品种,对于抵抗菊花白色锈... 详细信息

菊花白色锈病(Chrysanthemum White Rust,CWR)是菊花首要病害之一,在菊花生长过程中影响其产量与品质,严重时导致菊花死亡。挖掘菊花抗白色锈病的基因,探索其抗病的分子机理,通过转基因育种,培育菊花优良抗病新品种,对于抵抗菊花白色锈病具有重大意义。课题组前期通过转录组测序获得了差异表达基因CmTGAs,本研究从菊花白色锈病抗病品种‘C029’中克隆得到TGA转录因子基因CmTGA1和CmTGA3,对其进行生物信息学分析,通过VIGS沉默技术初步鉴定了CmTGAs基因的抗病性,为了进一步验证CmTGAs的功能,构建了过表达载体及CRISPR/Cas9敲除载体,进行稳定遗传转化后获得了抗性植株。并通过双分子荧光互补试验验证CmTGA1、CmTGA3与CmNPR1之间的互作关系,解析其抗病机理。本研究为揭示CmTGAs基因抵抗菊花白色锈病的分子机理奠定了理论基础,对于培育优良菊花抗病品种具有重要意义。本研究主要结果如下:1.从抗病品种‘C029’中克隆得到CmTGA1和CmTGA3两个基因。CmTGA1基因全长1014bp,CDS序列长657bp,开放阅读框有657bp,编码218个氨基酸,CmTGA3基因全长1680bp,CDS序列长1095bp,最大阅读框为1095bp,编码363个氨基酸。CmTGA1编码蛋白亚细胞定位于细胞质和细胞核中,相对分子质量为25294.95,理论等电点为4.99,蛋白分子式为CHNOS,是不稳定的亲水性蛋白。CmTGA3编码蛋白亚细胞定位于细胞核,相对分子质量为41530.10,理论等电点为7.24,蛋白分子式为CHNOS,是不稳定的亲水性蛋白。2.通过VIGS沉默技术分别获得‘C029’的CmTGA1和CmTGA3基因沉默株系。接菌处理后,SA通路中病程相关基因CmPRs及活性氧产生的关键基因CmRBOHD因CmTGA1和CmTGA3基因的沉默而表达下降,但SA通路的关键节点基因CmNPR1的表达量呈现缓慢上升的趋势。3.成功构建CmTGAs基因过表达载体,经遗传转化菊花后获得2株抗性植株。以CmTGA1基因为靶基因构建CRISPR/Cas9敲除载体,瞬时转化验证敲除靶点的可靠性,结果显示CmTGA1基因表达量约为野生型植株的21%～63%,经稳定遗传后获得4株抗性植株。4.双分子荧光互补试验证明,CmTGA1、CmTGA3与CmNPR1存在互作关系,表明CmTGAs可能通过与CmNPR1之间的互作调控CmPRs基因的表达,来参与抵抗菊花白色锈病。

关键词：菊花 CmTGAs 菊花白色锈病 CmNPR1 双分子荧光互补

菊花CmWRKY15-1通过调控CmNPR1的表达增强对菊花白色锈病的抗性

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菊花CmWRKY15-1通过调控CmNPR1的表达增强对菊花白色锈病的抗性

作者：高歌沈阳农业大学

学位级别：硕士

菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属名贵观赏花卉,在整个生命周期中,会面对多种胁迫,导致其死亡。由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病(Chrysanthemum white rust)是影响菊花品质的主要病害。通过转录组测... 详细信息

菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属名贵观赏花卉,在整个生命周期中,会面对多种胁迫,导致其死亡。由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病(Chrysanthemum white rust)是影响菊花品质的主要病害。通过转录组测序,筛选转录因子CmWRKY15-1下游水杨酸(SA)信号转导途径关键基因,探究CmWRKY15-1对CmNPR1的调控作用,明确CmWRKY15-1响应菊花白色锈病的分子机理,为利用抗逆WRKY转录因子提高菊花抗病能力和培育优良抗性新品种奠定基础。本研究以接菌处理后的抗病品种‘C029’野生型(WT)及CmWRKY15-1基因沉默株系(CmWRKY15-1-RNAi)为试验材料,进行转录组测序,获得差异表达基因CmNPR1,对其进行功能分析。通过GUS染色,酵母单杂交技术解析转录因子CmWRKY15-1对其靶基因CmNPR1在抵抗菊花白色锈病过程中的调控机制。研究结果如下:1.制备了12个生物样本(6个接菌前,6个接菌后)用于转录组测序,产生约100.8 GB净读数。De novo组装后获得Transcripts 326,062条,总长165,667,774 nt。将Transcripts进一步拼接分析后,获得272,669条Unigenes,总长152,620,397 nt。最后对Unigenes进行功能注释,这些基因被注释到‘转录翻译’、‘信号转导’等方面。2.从WT未接菌(W0)与WT接菌(WJ)及CmWRKY15-1-RNAi未接菌(R0)及CmWRKY15-1-RNAi接菌(RJ)中鉴定出5449和6128个差异表达基因。这些基因主要富集在‘代谢合成’、‘次级代谢合成’、‘苯丙烷生物合成’、‘核糖体’等途径。荧光定量对获得8个SA通路抗病相关差异基因表达水平进行验证,结果显示,其表达变化与转录组数据基本一致。最终选取SA信号通路关键基因CmNPR1进行后续研究。3.根据转录组测序数据,从抗病品种‘C029’中克隆获得CmNPR1的CDS全长序列1670 bp,通过病毒诱导基因沉默技术获得‘C029’的CmNPR1基因沉默株系。荧光定量显示,CmNPR1沉默导致SA通路中病程相关PR基因表达下降,表明CmNPR1通过调控PR基因参与抵抗菊花白色锈病。4.使用hi TAIL-PCR技术克隆CmNPR1基因的1685 bp启动子并发现该序列包含大量参与胁迫的顺式作用元件,其中包括与WRKY转录因子结合的病原体诱导元件W-box。RCR获得CmNPR1启动子1个全长及2个5’端缺失片段,构建CmNPR1启动子驱动GUS基因的表达载体,并瞬时转化菊花‘C029’,进行GUS组织的化学染色。结果表明,CmNPR1启动子具有活性,并在48 h时活性最强,能够响应菊花白色锈病侵染。5.将CmNPR1启动子分成2个短截区域,酵母单杂证明,CmWRKY15-1转录因子能够结合到含有W-box的CmNPR1启动子区,表明CmWRKY15-1的下游靶基因为CmNPR1,并通过与CmNPR1启动子的互相作用,调控CmNPR1表达,参与抵抗菊花白色锈病。

关键词：菊花 CmWRKY15-1 菊花白色锈病 CmNPR1 调控机制

菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

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菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

作者：熊超明沈阳农业大学

学位级别：硕士

菊花不仅是世界范围重要的观赏花卉,而且在医药、化工等方面具有重要的应用价值,其已成为我国花卉产业中的支柱力量。菊花白色锈病是一种在世界范围内广泛传播的菊花病害,该病害不仅严重影响菊花的生长发育与生产,而且极大的限制了菊花... 详细信息

菊花不仅是世界范围重要的观赏花卉,而且在医药、化工等方面具有重要的应用价值,其已成为我国花卉产业中的支柱力量。菊花白色锈病是一种在世界范围内广泛传播的菊花病害,该病害不仅严重影响菊花的生长发育与生产,而且极大的限制了菊花的推广与应用。目前,对于菊花白色锈病的研究主要集中于抗病品种的筛选,化学药剂防治及病理研究等方面,而在分子生物学方面的研究较少,尤其是抗病相关基因的研究更少。在前期研究的基础上,本研究克隆得到了与菊花抗白色锈病相关的基因CmDREBa-2,并进行了表达分析与载体构建,为进一步了解菊花白色锈病的分子机制奠定了基础,也为培养抗病新品种提供了候选基因。1.根据转录组数据,利用RACE和RT-PCR技术克隆得到一个DREB类基因。该基因cDNA全长834bp,基因的开放阅读框有291 bp,编码96个氨基酸;氨基酸序列分析表明,该基因含有1个AP2结构域,并且结构域中第十四位氨基酸为DREB家族标志的缬氨酸(V),氨基酸序列比对发现该蛋白的AP2结构域与已公布的CmDREBa蛋白一样,第十九位都为组氨酸(H),而不是大部分DREB蛋白含有谷氨酸(E),且氨基酸进化树分析表明该蛋白与CmDREBa蛋白同源关系最近,因此将此基因命名为CmDREBa-2。并用ProtParam对该基因编码的蛋白进行了理化性质分析,结果表明,该蛋白相对分子质量为11159.04,理论等电点11.34,氨基酸序列中精氨酸(Arg)的使用率最高,占14.6%,蛋白分子式为CHNOS;该蛋白,为不稳定、亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,该蛋白于细胞核中发挥作用。2.采用实时荧光定量分析了CmDREBa-2基因的表达模式,白色锈病病原菌处理后该基因在叶子中的表达量最高,和白色锈病危害菊花的部位相同;在菊花白色锈病诱导下,CmDREBa-2基因在高抗品种‘C029’中的表达量出现明显变化,在6h达到峰值,并且整体表达量高于对照组;激素处理结果表明,CmDREBa-2基因能够响应乙烯利(ETH)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,说明该基因通过多种途径参与菊花抵御白色锈病的调节;非生物胁迫处理表明,CmDREBa-2基因受干旱,盐,高温和低温的诱导,但对干旱最不敏感,对高温最为敏感。3.我们构建了以pBI-121为基础表达载体的CmDREBa-2基因超表达载体pBI-121-CmDREBa-2,通过菌液PCR和双酶切验证了载体的正确性,并转化农杆菌EHA105感受态,为下一步转化植株奠定基础;还构建了以AP2结构域上游175bp片段为干扰片段,pTRV1和pTRV2为载体的沉默表达载体,同样验证其正确性后转化农杆菌备用。

关键词：菊花白色锈病 DREB转录因子基因生物信息学分析表达分析

菊花抗白色锈病相关基因CmWRKY15-1的克隆及功能验证

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菊花抗白色锈病相关基因CmWRKY15-1的克隆及功能验证

作者：延昕沈阳农业大学

学位级别：硕士

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病严重降低了菊花的观赏品质及产量,制约了菊花产业的发展,目前尚未有有效的方法根治该病。分子生物学的发展为从分子层面防治该病提供了可能,发掘菊花抗病基因,通过转基因技术... 详细信息

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病严重降低了菊花的观赏品质及产量,制约了菊花产业的发展,目前尚未有有效的方法根治该病。分子生物学的发展为从分子层面防治该病提供了可能,发掘菊花抗病基因,通过转基因技术培育菊花抗病新品种将是最直接有效的方法。在课题组前期研究基础上,本研究中对抗、感品种的差异表达基因CmWRKY15-1进行了克隆、生物信息学分析、表达分析、遗传转化及功能鉴定,研究结果如下:(1)基于菊花白色锈病病原菌诱导的菊花转录组数据库,从抗病品种‘C029’中克隆得到CmWRKY15-1基因,其CDS全长为810bp,共编码269个氨基酸,含有一个WRKYGQK保守结构和一个C-H锌指结构,属于Ⅱ类WRKY蛋白;相对分子质量为30720.71,理论等电点5.65,为不稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位表明该蛋白位于细胞核上;同源性分析发现其除与向日葵、刺苞菜蓟等菊科植物亲缘关系较近外,与胡萝卜、欧洲油菜等植物的亲缘关系也比较近。(2)以菊花Actin基因为内参基因,利用qRT-PCR方法分析了CmWRKY15-1基因在抗、感菊花品种中的表达水平,接菌处理后,抗病品种‘C029’中的表达水平显著高于感病品种‘神马’,且变化更为明显。(3)建立感病品种‘神马’的遗传转化体系:通过预培养3d,用OD=0.5-0.6,MS水稀释50倍的含CmWRKY15-1-PBI121的农杆菌菌液侵染7min,经共培养3d,延迟培养3d后进行筛选培养,共获得23株抗性植株,采用普通PCR、半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR法验证CmWRKY15-1基因的整合情况及表达情况,确定共有6株阳性转基因植株,转化效率为26.09%,筛选出CmWRKY15-1基因表达量约为野生型55倍的过表达株系,进行功能验证。(4)经白色锈病病原菌处理后,转基因植株的病情指数显著低于野生型植株,在转基因株系及野生型植株体内PR1基因的表达量均呈先上升后下降的趋势,且转基因株系的变化更明显,而PDF1.2在两者中的变化均不明显。菊花CmWRKY15-1基因可能通过SA信号转导途径正向调控菊花对白色锈病的防御反应。

关键词：菊花白色锈病 CmWRKY15-1基因生物信息学分析遗传转化功能验证

CmWRKY15-1启动子的克隆及功能验证

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沈阳农业大学学报 2021年第6期52卷 743-750页

作者：付雨涵张新金芮冰毛洪玉沈阳农业大学林学院沈阳110161

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病,对菊花的栽培产业造成了严重的经济损失。抗病品种培育是解决白色锈病对菊花产业造成巨大危害的重要尝试,通过分析CmWRKY15-1启动子的活性和功能,为抗病基因的发掘和抗病品... 详细信息

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病,对菊花的栽培产业造成了严重的经济损失。抗病品种培育是解决白色锈病对菊花产业造成巨大危害的重要尝试,通过分析CmWRKY15-1启动子的活性和功能,为抗病基因的发掘和抗病品种改良提供参考。利用HiTAIL-PCR技术,从菊花C029中克隆CmWRKY15-1的启动子序列,将获得的启动子序列通过PlantCARE和PLACE软件进行顺式作用元件分析。为进一步探究启动子的功能,构建CmWRKY15-1启动子控制GUS基因植物表达载体,用农杆菌介导法转化菊花C029,对转基因阳性植株进行GUS组织化学染色,验证CmWRKY15-1启动子的活性。并通过酵母单杂交技术探究NPR1与CmWRKY15-1启动子之间的调控关系。结果表明:克隆出1485bp的CmWRKY15-1启动子序列,软件分析表明其含有病原菌诱导元件W-box和GT1-motif、防御应激元件TC-rich repeats、SA诱导元件As1/ocs等。GUS组织化学染色结果显示,当堀氏菊柄锈菌诱导48h时,叶片上的蓝色面积最大且颜色深,说明CmWRKY15-1启动子具有很强的病原菌诱导活性。此外,通过酵母单杂交技术证明了NPR1可以结合CmWRKY15-1启动子序列,参与防御菊花白色锈病的过程。

关键词：菊花白色锈病 CmWRKY15-1 HiTAIL-PCR GUS 酵母单杂

农杆菌介导CmWRKY15-1基因对菊花的遗传转化

维普期刊数据库

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农杆菌介导CmWRKY15-1基因对菊花的遗传转化

作者：何姗沈阳农业大学

学位级别：硕士

菊花(Chrysanthemum morifolium)原产于我国,是菊科菊属的多年生宿根花卉。菊花白色锈病作为一种十分严重的世界性病害,已经被多个国家和地区列为检疫性病害。本研究以抗病品种‘C029’及感病品种‘紫燕’为试验材料,首先通过添加不同... 详细信息

菊花(Chrysanthemum morifolium)原产于我国,是菊科菊属的多年生宿根花卉。菊花白色锈病作为一种十分严重的世界性病害,已经被多个国家和地区列为检疫性病害。本研究以抗病品种‘C029’及感病品种‘紫燕’为试验材料,首先通过添加不同浓度的生长调节剂,研究了对‘C029’及‘紫燕’的茎段增殖、愈伤组织诱导及不定芽分化的影响,建立了优质再生体系;在此基础上,建立了‘C029’与‘紫燕’的高效遗传转化体系,并获得了‘紫燕’的转Cm WRKY15-1基因的过表达体系,为今后菊花白色锈病的防治及抗病品种的育种工作提供一定的理论依据。主要试验结果如下:1.建立了‘C029’的再生体系。‘C029’无菌苗茎段增殖的最佳培养基为:MS+1.0mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA;叶盘愈伤组织生成的最佳培养基为:MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA;叶盘不定芽分化的最佳培养基为:MS+1.5 mg·L6-BA+0.5mg·LNAA。2.建立了‘紫燕’的再生体系。‘紫燕’无菌苗茎段增殖的最佳培养基为:MS+2.0mg·L6-BA+0.3 mg·LNAA;叶盘愈伤组织生成的最佳培养基为:MS+2.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA;叶盘不定芽分化的最佳培养基为:MS+2.0 mg·L6-BA+0.2mg·LNAA。3.建立了‘C029’的遗传转化体系。卡那霉素抑制抗性芽分化的临界浓度为7.5mg·L;菌液最佳侵染浓度OD=0.6;菌液最佳侵染时间为9 min;最佳的预培养时间为2 d;最佳的共培养时间为2 d;最佳的延迟培养时间为2 d。4.建立了‘紫燕’的遗传转化体系。卡那霉素抑制抗性芽分化的临界浓度为20mg·L;菌液最佳侵染浓度OD=0.5;菌液最佳侵染时间为7 min;最佳的预培养时间为2 d;最佳的共培养时间为2 d;最佳的延迟培养时间为2 d。5.获得了‘C029’获得抗性植株7株,采用普通PCR及qRT-PCR法验证Cm WRKY15-1基因的整合情况及表达情况,共得到阳性植株3株,转化效率为42.86%。6.获得了‘紫燕’获得抗性植株9株,采用普通PCR及qRT-PCR法验证Cm WRKY15-1基因的整合情况及表达情况,共得到阳性植株5株,转化效率为55.56%。

关键词：菊花遗传转化过表达菊花白色锈病