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饲料研究 2022年第8期45卷 73-77页

作者：陈显玲张鹏农秀丽卢丽婷杨福川麦雪兰黄安甲苏龙广西科技师范学院食品与生化工程学院广西来宾546119 广西糖资源工程技术研究中心广西来宾546119

试验旨在研究菊糖蔗糖酶固定化条件。以菊糖蔗糖酶酶活为考察指标,通过单因素试验及响应面试验对固定化条件进行优化。结果表明,最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度2.8%、氯化钙浓度为3.8%、固定化时间3.0 h、戊二醛浓度0.035%、交联30 min... 详细信息

试验旨在研究菊糖蔗糖酶固定化条件。以菊糖蔗糖酶酶活为考察指标,通过单因素试验及响应面试验对固定化条件进行优化。结果表明,最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度2.8%、氯化钙浓度为3.8%、固定化时间3.0 h、戊二醛浓度0.035%、交联30 min。此条件下固定化菊糖蔗糖酶的酶活为78.82 U/g。研究表明,与游离酶相比,固定化菊糖蔗糖酶的热稳定性和pH值稳定性均有所提高。固定化酶在循环操作10次后,酶活仍然保持初次酶活性的61.15%。

关键词：菊糖蔗糖酶海藻酸钠固定化酶响应面法

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菊糖蔗糖酶的性质鉴定及菊糖的酶法合成

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生物工程学报 2021年第1期37卷 266-275页

作者：倪大伟徐炜陈自卫张文立沐万孟江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122

菊糖作为益生元和膳食纤维,具有许多重要的生理功能,广泛应用于食品、医药等领域。微生物菊糖蔗糖酶可以以蔗糖为底物合成较植物菊糖具有更高分子量的菊糖。文中通过基因数据库筛选获得一段拟表达菊糖蔗糖酶的基因。通过N-端和C-端截断... 详细信息

菊糖作为益生元和膳食纤维,具有许多重要的生理功能,广泛应用于食品、医药等领域。微生物菊糖蔗糖酶可以以蔗糖为底物合成较植物菊糖具有更高分子量的菊糖。文中通过基因数据库筛选获得一段拟表达菊糖蔗糖酶的基因。通过N-端和C-端截断的方式,保留中间催化域,构建重组质粒。将重组质粒在大肠杆菌表达系统中表达,粗酶液经Ni2+亲和层析纯化,获得分子量约为65kDa的重组酶。以蔗糖为唯一底物时,重组酶的最适pH和温度分别为5.5和45℃。金属离子在不同程度上抑制酶的活性。产物多糖分离纯化后,使用核磁共振鉴定产物多糖为β-(2,1)糖苷键连接的菊糖。最后对菊糖合成的条件进行优化,结果表明:以700 g/L的蔗糖为底物,加酶量4 U/mL时,7 h后菊糖产量达到最大,约为287 g/L,蔗糖到菊糖的转化率约为41%。

关键词：菊糖蔗糖酶酶学性质菊糖酶法合成

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微生物菊糖蔗糖酶及在食品中的应用研究进展

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食品科学 2021年第7期42卷 260-266页

作者：倪大伟徐炜张文立沐万孟江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122

菊糖作为一种可溶性膳食纤维,具有良好的理化性质和重要的生理功能,因此,在食品中应用广泛。菊糖蔗糖酶能够以蔗糖为唯一底物,一步合成高分子质量的微生物菊糖。目前鉴定的菊糖蔗糖酶有15种微生物来源,其中一种的晶体结构已经被解析。... 详细信息

菊糖作为一种可溶性膳食纤维,具有良好的理化性质和重要的生理功能,因此,在食品中应用广泛。菊糖蔗糖酶能够以蔗糖为唯一底物,一步合成高分子质量的微生物菊糖。目前鉴定的菊糖蔗糖酶有15种微生物来源,其中一种的晶体结构已经被解析。国内关于菊糖蔗糖酶的研究鲜有报道。本文对菊糖蔗糖酶的晶体结构和反应机理进行了综合分析。着重讨论了菊糖的链长调控以及菊糖蔗糖酶在生产高分子质量菊糖、低聚果糖、新型低聚糖和菊糖纳米材料方面的应用。最后,结合菊糖蔗糖酶的研究,探讨其发展趋势。

关键词：菊糖蔗糖酶微生物菊糖晶体结构催化机理应用

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菊糖蔗糖酶的性质鉴定及分子改造研究

菊糖蔗糖酶的性质鉴定及分子改造研究

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作者：倪大伟江南大学

学位级别：硕士

自然界中存在两种果聚糖,按照糖苷键型的差异可分为菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量丰富,具有许多优异的性质和生理功能,已被作为可溶性膳食纤维,应用于食品、医药等许多领域。目前,工业化的菊糖大多来自植物菊苣,相反,l... 详细信息

自然界中存在两种果聚糖,按照糖苷键型的差异可分为菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量丰富,具有许多优异的性质和生理功能,已被作为可溶性膳食纤维,应用于食品、医药等许多领域。目前,工业化的菊糖大多来自植物菊苣,相反,levan型果聚糖主要来自微生物,植物中含量很少。国内尚没有关于微生物来源菊糖的报道,实际上,一些微生物可通过菊糖蔗糖酶(Inulosucrase,EC:2.***.4.9)以蔗糖为唯一底物,一步合成菊糖。众所周知,多糖的分子量是影响其性质和功能的关键因素,而微生物菊糖与植物菊糖的主要不同在于分子量,微生物菊糖的分子量一般在10 g/mol以上,是植物菊糖的百倍。即使如此,微生物菊糖及菊糖蔗糖酶仍未得到足够的重视。本课题鉴定了一种来源于乳酸菌*** DSM 20604的菊糖蔗糖酶,并对酶学性质和产物多糖的键型进行鉴定。之后,对菊糖合成条件进行优化。最后,通过定点突变获得了使酶活和稳定性提高的正突变。本课题利用不同的N-端截断方式构建重组菊糖蔗糖酶。相应的截断基因插入进载体pET-22b(+)中,构建重组质粒。重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)内,IPTG诱导重组酶的过量表达。通过检测两种截断的菊糖蔗糖酶在最适pH和温度下的活力表明:不同的N-端截断方式仅改变了菊糖蔗糖酶的最适pH和温度,对酶活的影响不大。酶学性质鉴定表明,Laga-ISase(截断信号肽、N-端的101个氨基酸和C-端)总酶活的最适pH和最适温度分别为pH 5.5和35℃。大部分二价金属离子对Laga-ISase酶活有促进作用,其中Mn可以将酶活提高至157%。热稳定性研究表明,45℃保温3 h,残余酶活仍保持为原始酶活的84%,为目前已经鉴定的菊糖蔗糖酶中热稳定性最高的。结构稳定性研究表明,Laga-ISase的变性温度为55℃。对Laga-ISase的反应动力学研究表明,该酶的总酶活和转糖苷酶活的反应动力学行为不遵循米氏方程。而水解酶活符合米氏方程底物饱和的典型特点,且水解酶活的K为44.12 mmol/L。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振检测产物多糖的糖苷键型,确定产物为β-(2,1)糖苷键连接的菊糖。以30%蔗糖为底物,对酶法合成菊糖的条件进行优化,获得菊糖合成的最适加酶量和时间分别为:4.5 U/g蔗糖和1.5 h。在最适条件下,获得的菊糖的分子量为5.86′10 g/mol。之后,通过分子生物学手段结合计算模拟和理性设计,获得13个定点突变的突变体。通过对突变体酶的活力和结构稳定性进行研究,发现了对酶活和结构稳定性起重要作用的关键位点。其中,Q196E的总酶活和T值分别降低至野生酶的37.8%和54.2℃,这表明残基Gln196对酶的活力和结构稳定性具有重要作用。另外,获得了使酶活提高的正突变,突变体D288E的酶活为野生酶的131.5%。大部分突变体的T值增加,其中A310E、S346A、I478M和A491S的T值分别较野生酶提高了1.38、1.39、1.83和1.31℃。

关键词：菊糖菊糖蔗糖酶 N-端截断酶学性质分子改造

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菊糖蔗糖酶和β-半乳糖苷酶的鉴定及其性质研究

菊糖蔗糖酶和β-半乳糖苷酶的鉴定及其性质研究

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作者：翟璐安徽大学

学位级别：硕士

果聚糖是广泛应用于食品、保健品和制药工业中的功能性多糖。目前,获得果聚糖的方法有两种,一种是植物来源,另一种是微生物来源的酶直接合成。细菌来源的合成果聚糖的酶有两种,菊糖蔗糖酶(EC 2.***.1.9)和果聚糖蔗糖酶(EC 2.***.1.10)。其中... 详细信息

果聚糖是广泛应用于食品、保健品和制药工业中的功能性多糖。目前,获得果聚糖的方法有两种,一种是植物来源,另一种是微生物来源的酶直接合成。细菌来源的合成果聚糖的酶有两种,菊糖蔗糖酶(EC 2.***.1.9)和果聚糖蔗糖酶(EC 2.***.1.10)。其中,菊糖蔗糖酶的研究很少,酶学特性和晶体结构信息都不是很清楚。为了获得催化效率较好的菊糖蔗糖酶,本文从CAZy数据库中筛选了一段来源于Brevibacillus formosus的糖苷水解酶。通过对***来源的糖苷水解酶序列进行分析,该序列与Bacillus korlensis(WP660521 62.1)来源的果聚糖蔗糖酶相似性为78.55%,与Bacillus agaradhaerens WDG185(ATN45518.1)来源的菊糖蔗糖酶的相似性为72.01%,将其命名为Inu-Bfor。通过大肠杆菌表达系统获得了高表达量的可溶性蛋白(蛋白含量约为1.5 mg/mL),并进行了酶学性质的研究。Inu-Bfor最适温度为35℃,具有极好的热稳定性,45℃条件下的半衰期为34 h。最适pH为6.0,pH5.0条件下,148 h后仍然保留80%的酶活力,pH7.0的条件下半衰期为100 h,表明Inu-Bfor在中酸性条件下pH稳定性极好。Inu-B for只水解含果糖分子与葡萄糖分子以β-(1-2)糖苷键连接的底物。除SDS能完全抑制Inu-Bfor的酶活外,金属离子和其他化学试剂对Inu-Bfor表现出不同程度的促进和抑制作用。高浓度的蔗糖有利于Inu-B for合成果聚糖,反应8 h后果聚糖合成量达到最大值7 mg/mL。由NMR、HPLC和FTIR验证了Inu-Bfor合成的果聚糖为菊糖型果聚糖。由此,表明Inu-Bfor是具有广泛应用潜景的菊糖蔗糖酶。β-半乳糖苷酶(EC 3.***.2.23)能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是一种重要的工业化酶。商业化的β-半乳糖苷酶主要有两种,一种是黑曲霉来源于的β-半乳糖苷酶,另一种是酵母菌来源的β-半乳糖苷酶。商业化的β-半乳糖苷酶主要应用领域是牛奶中乳糖的水解,而牛奶的pH为中性。市场中又缺乏同时在中性pH左右和高温条件下的β-半乳糖苷酶。而细菌来源的高温β-半乳糖苷酶可以高温催化牛奶中的乳糖,并能防止牛奶被杂菌污染。为了获得高温的催化效率好的β-半乳糖苷酶,本文从CAZy数据库中筛选了一段来源于Truepera radiovictrix的糖苷水解酶。通过对***来源的糖苷水解酶序列进行分析,该序列与Synthetic construct(API85502.1)来源的GH1家族糖苷水解酶相似性为61.22%,与Thermus thermophilus(AAS82372.1)来源的β-半乳糖苷酶相似性为57%,具有典型的β-半乳糖苷酶域,将其命名为BgalT。通过大肠杆菌表达系统获得了可溶性蛋白,并进行了酶学性质研究。BgalT最适温度为65℃,它的热稳定性很好,65℃条件下的半衰期为2 h。最适pH为6.5,在pH 4.0-9.0之间,随着pH值的增大,其稳定性越来越好。BagIT具有广泛的底物特异性。除5 mM Cd2+和10 mM SDS能完全抑制酶活外,其他金属离子对BgalT表现不同程度的促进和抑制作用,BgalT对化学试剂表现出一定的耐受性。高浓度的有机试剂、葡萄糖和半乳糖都能抑制BgalT的酶活。BgalT的比酶活高达878.6土14.6 U/mg,以oNPG为底物时,Km=6.24 mM,Kcat=1657.2 S-1,Kcat/Km=65.6 sS-1mM-1,以乳糖作为底物时,Km=288.5 mM,Kcat=22.7 S-1,Kcat/K =0.08 S-1 mM-1。与已报道的细菌来源的β-半乳糖苷酶相比,BgalT在55℃,1.8 U/mL的酶量时,仅5h就能完全水解脱脂牛奶中的乳糖,表明BgalT具有很高的催化效率。

关键词：果聚糖菊糖蔗糖酶 β-半乳糖苷酶酶学性质

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