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新型甜味剂莱鲍迪苷d和莱鲍迪苷M的生物转化进展

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食品与发酵工业 2023年第7期49卷 289-296页

作者：郭保党饶义剑江南大学生物工程学院江苏无锡214122

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷d(rebaudioside d,Reb d)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感,被认为是高热量糖的理想替代品,其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb d和Reb M的结... 详细信息

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷d(rebaudioside d,Reb d)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感,被认为是高热量糖的理想替代品,其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb d和Reb M的结构、口感、水溶性、安全性以及合成相关的糖基转移酶的研究进展,并重点介绍了Reb d和Reb M合成相关的糖基转移酶的蛋白质结构、催化机制以及蛋白质理性改造的研究进展,以期为Reb d和Reb M的开发和应用提供参考。

关键词：莱鲍迪苷d 莱鲍迪苷M 糖基转移酶蛋白质改造生物转化

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双酶级联催化合成莱鲍迪苷d的研究

双酶级联催化合成莱鲍迪苷D的研究

作者：刘晓洁北京化工大学

学位级别：硕士

蔗糖等高热量甜味剂的过量摄入,导致许多国家的公共卫生负担日益加重,这促使人们开始寻求“无糖”、“低卡”的天然甜味剂。来源于甜叶菊的莱鲍迪苷d(Rd)是一种热量较低且甜度较高的天然甜味剂,但提取得到的Rd含量低且杂质较多,无法满... 详细信息

蔗糖等高热量甜味剂的过量摄入,导致许多国家的公共卫生负担日益加重,这促使人们开始寻求“无糖”、“低卡”的天然甜味剂。来源于甜叶菊的莱鲍迪苷d(Rd)是一种热量较低且甜度较高的天然甜味剂,但提取得到的Rd含量低且杂质较多,无法满足市场的需求。本研究将葡萄糖基转移酶(EUGT11)和蔗糖合成酶(SUS)级联催化RA合成Rd,实现了尿苷二磷酸葡萄糖(UdPG)的原位再生,无需外源添加UdPG即可合成Rd,并用交联酶聚集体技术和磁性纳米载体固定酶,提高其重复使用性能,主要研究如下:1.通过基因工程技术构建转基因工程菌,表达目标蛋白并纯化,用HPLC分析,筛选得到具有催化活性的葡萄糖基转移酶(EUGT11)和蔗糖合成酶(SUS)。确定游离EUGT11的最适温度是37℃,最适p H为9.0;SUS的最适温度是35℃,最适p H为8.5,且双酶级联成功合成Rd。2.探索蛋白质的沉淀条件和交联条件,得到制备EUGT11-交联酶聚集体(EUGT11-CLEAs)和SUS-交联酶聚集体(SUS-CLEAs)的最佳条件,即采用50%的硫酸铵沉淀EUGT11,0.25%戊二醛交联0.5 h;30%的硫酸铵沉淀SUS,0.15%戊二醛交联1.25 h。确定EUGT11-CLEAs和SUS-CLEAs的最适温度均为45℃,最适p H分别为7.5和9.0。固定化酶对温度和储存时间的耐受性有一定程度的提高且可以多次循环使用。3.制备Uio-66、FeO@Uio-66、FeO@Zr固定酶,探究固定化酶的性质及稳定性,发现固定化酶具有良好的稳定性,对不同的p H和温度都显示出良好的耐受性,且FeO@Uio-66载体固定酶后的重复使用效果较好,酶活性损失较少。对固定化前后的FeO@Uio-66进行SEM,TEM,FT-IR,XRd,BET,VSM,TG和TEM-EdS表征,发现固定化过程与固定化酶的循环使用过程对载体均没有产生影响。优化固定化条件、双酶比例、底物比例,探索固定化酶的动力学参数和重复使用性能,并进一步优化转化率。结果表明,EUGT11加入25 mg固定40 min,SUS加入25 mg固定30 min得到活性最佳的固定化酶;EUGT11与SUS最佳比例为1:1,RA、蔗糖和UdP最佳比例为2:2:3;固定化酶重复使用8次后活性仍然可保留原活性的80%左右;在SUS反应60 min后加入EUGT11对应的转化率较高;游离酶反应10 h后转化率达到57%且不再发生变化,但固定化酶在10 h达到相近的转化率后继续反应,24 h后转化率为84%,明显高于游离酶。

关键词：莱鲍迪苷A 莱鲍迪苷d 双酶级联固定化酶交联酶聚集体磁性纳米载体

定点突变提高糖基转移酶YojK的热稳定性以高效合成莱鲍迪苷d

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定点突变提高糖基转移酶YojK的热稳定性以高效合成莱鲍迪苷D

作者：杨赛江南大学

学位级别：硕士

莱鲍迪苷d(rebaudioside d,Reb d)是一种甜叶菊来源的天然甜味剂,因其热量低、甜度高、口感好,具有极大的市场潜力。但Reb d在甜叶菊中含量极低,提取和纯化困难,且化学合成复杂,以莱鲍迪苷A(rebaudioside A,Reb A)为底物,通过酶法制备Re... 详细信息

莱鲍迪苷d(rebaudioside d,Reb d)是一种甜叶菊来源的天然甜味剂,因其热量低、甜度高、口感好,具有极大的市场潜力。但Reb d在甜叶菊中含量极低,提取和纯化困难,且化学合成复杂,以莱鲍迪苷A(rebaudioside A,Reb A)为底物,通过酶法制备Reb d是目前获得Reb d的主要途径。本实验室前期筛选得到一种来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的糖基转移酶YojK,该酶能够将Reb A高效转化为Reb d,但较差的热稳定性限制了其工业化应用的价值。为提升YojK的应用价值,本论文通过理性设计构建突变文库,通过新的氢键和盐桥的增加及蛋白表面电荷分布的优化高效地提高了YojK的热稳定性,并基于突变体的晶体结构解析了热稳定性提高的分子机制。主要研究结果如下:(1)通过理性设计获得了YojK的突变文库。首先使用在线网站PROSS和Fire Prot进行预测,将包含44个突变的突变交集作为起始突变文库。进一步使用deep ddG进行蛋白折叠自由能计算,删除潜在的假阳性突变。为了避免催化活性的损失,通过结构分析去除参与催化反应的关键位点,并利用Consurf和GREMLIN进行序列保守性分析进一步缩减突变文库,最终获得含有d87I、V115I、S158E、d169K、L199N、A128H、L253F、T273I和A369K等9个突变体的突变文库。(2)获得了热稳定性提高的组合突变体YojK。对上述9个突变体进行酶活和热稳定性测试,突变体S158E、A218H和A369K的热稳定性和酶活相较野生型均有所提升。进一步通过组合突变得到突变体YojK(YojK-S158E/A218H/A369K),其解折叠温度和最适温度分别提高了3.36和10℃。在50℃条件下,其酶活半衰期为58.64 h,是野生型的27.15倍。同时,突变体YojK的酶活也有所提高,为YojK的1.39倍。(3)解析了YojK热稳定性提高的分子机制。为了对热稳定性提高的分子机制进行研究,解析获得了分辨率为2.5(?)的YojK晶体结构,PdB登录号为8H5d,并以此为基础利用分子动力学模拟对YojK-UdP和YojK-UdP蛋白中氢键和盐桥的数量进行动态分析。与YojK相比,YojK结构中多个区域刚性增强,其氢键和盐桥数量分别从198±9和26±3增加到205±7和29±3。突变S158E和A218H导致了周围氨基酸新的氢键和盐桥的形成减小了氨基酸的摆动范围,增强了这些区域的刚性,并与突变A369K导致的蛋白质表面电荷分布优化协同提高了YojK的热稳定性。(4)利用YojK实现了Reb d的高效制备。基于YojK热稳定性的提高,利用分批补料的策略,对其制备Reb d的效率进行研究。相较于YojK,YojK显示出较高的催化活性且酶活损失明显较慢。12 h内将25 m M Reb A转化为21.93 m M Reb d,转化率为87.7%,相较YojK提高了23.7%。

关键词：莱鲍迪苷d 糖基转移酶蛋白质工程分子动力学模拟

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生物催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷d的研究

生物催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D的研究

作者：李铭敏浙江工业大学

学位级别：硕士

甜菊糖苷(steviol glycosides,SGs)是甜菊叶片中提取的具有低热量、高甜度的天然甜味剂,不仅可作为食品添加剂,还具有一定的药用价值。甜菊糖苷均为双萜衍生物甜菊醇的糖苷,甜菊叶中已经发现的甜菊糖苷已经超过100多种,从甜度和回味等... 详细信息

甜菊糖苷(steviol glycosides,SGs)是甜菊叶片中提取的具有低热量、高甜度的天然甜味剂,不仅可作为食品添加剂,还具有一定的药用价值。甜菊糖苷均为双萜衍生物甜菊醇的糖苷,甜菊叶中已经发现的甜菊糖苷已经超过100多种,从甜度和回味等味质综合评价看,莱鲍迪苷d的味质最好。基于国内外研究进展,本实验旨在通过葡萄糖基转移酶的基因表达,在莱鲍迪苷A的C位侧链上转入一个葡萄糖基,特异性合成莱鲍迪苷d。首先,筛选获得了具有葡萄糖基转移活性的基因EUGT11,对其进行密码子优化、合成,并构建了pESC-LEU-EUGT11和pVTU26-EUGT11重组质粒。将重组质粒转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A、Saccharomyces cerevisiae BY4741表达宿主中,成功地表达了目的基因。通过基因工程技术再次构建了一株具有葡萄糖转移酶活性Escherichia coli BL21(dE3)Codon Plus-RIL/pET-28a(+)-EUGT11菌株,诱导表达后,获得了大小为51kda的目的蛋白。通过高效液相检测其酶活,从构建好的重组菌种筛选出一株相对酶活最高的菌株进行生物催化反应的条件优化。对该葡萄糖转移酶全细胞催化的研究发现:催化反应最适p H为7.0,稳定性和活力均达到最高。初始反应最适温度为35℃,在该温度下相对酶活最高;但温度稳定性不如30℃,在30℃、35℃和40℃下的半衰期分别为8.67h,4.99h和1.31h。添加金属离子和EdTA对酶活有一定的抑制作用。在最优催化反应条件下,即:在PBS缓冲液(pH 7.0、50 mM)中,反应温度35℃,底物浓度比例UdPG:莱鲍迪苷A=2:1(c/c),莱鲍迪苷A浓度0.25 g/L,细胞浓度60 g/L时,反应5小时,产率可以达到87.36%。该酶酶活为62.7U/g。

关键词：莱鲍迪苷A 莱鲍迪苷d 葡萄糖转移酶 UdPG 生物催化

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重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷d

工业微生物 2017年第5期47卷 1-7页

作者：杨玉凤费理文李建华郝千里杨靖亚王勇上海海洋大学食品学院上海201306 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所中国科学院分子植物科学卓越创新中心中国科学院合成生物学重点实验室上海200032

莱鲍迪苷d(Rebaudioside d,Rd)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成Rd。以水稻c dNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株*** BL21(p ETdue... 详细信息

莱鲍迪苷d(Rebaudioside d,Rd)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成Rd。以水稻c dNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株*** BL21(p ETduet-eugt11),并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。通过Ni柱亲和层析纯化并在体外酶催化反应表征了其催化活性。将重组菌BL21(p ETduet-eugt11)应用于催化合成Rd研究。探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UdPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示,在菌体密度0.16 g湿细胞/m L反应液,底物RA浓度为1.0 mmol/L,pH 8.0,60 mmol/L柠檬酸钠,1%二甲苯,0.1 mmol/L Zn Cl2,12.0 mmol/L UdPG,反应温度42℃,反应时间24 h的条件下,Rd产量为123.6 mg/L(约0.1 mmol/L)。

关键词：甜菊糖莱鲍迪苷d EUGT11 重组大肠杆菌全细胞催化

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α-1,6-单葡糖基莱鲍迪苷A的合成

中国食品添加剂 2020年第7期31卷 5-14页

作者：王婉洁沈洁刘湘夏咏梅江南大学化学与材料工程学院无锡214122 食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

莱鲍迪苷d(Rd)是甜味特性最好的甜菊糖苷,也是单葡萄糖基取代的莱鲍迪苷A(RA);但Rd在甜叶菊提取物中含量很低且溶解度只有莱鲍迪苷A的十分之一。本实验使用来自*** CICC23234.的交替糖蔗糖酶定向催化莱鲍迪苷A C19位上的α-1,6的葡萄糖... 详细信息

莱鲍迪苷d(Rd)是甜味特性最好的甜菊糖苷,也是单葡萄糖基取代的莱鲍迪苷A(RA);但Rd在甜叶菊提取物中含量很低且溶解度只有莱鲍迪苷A的十分之一。本实验使用来自*** CICC23234.的交替糖蔗糖酶定向催化莱鲍迪苷A C19位上的α-1,6的葡萄糖基化,得到了一种莱鲍迪苷d的同分异构体,即单葡萄糖基莱鲍迪苷A(RAG1)。25℃下,RAG1在水中的溶解度分别是RA的13倍,是Rd的148倍。感官分析实验表明,0.01%(w/v)的RAG1溶液的甜度是蔗糖的190~210倍,且甜味纯正,无后苦味。

关键词：莱鲍迪苷A 莱鲍迪苷d 糖基转移溶解度

番茄源糖基转移酶UGTSL2的重组表达及其诱导条件优化

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食品安全导刊 2024年第36期 124-129+133页

作者：詹依雅夏菠湖南农业大学食品科学技术学院

来自甜叶菊叶片的莱鲍迪苷d因其高甜度、低热量被认为是理想的天然甜味剂，又因其产量少、相关合成酶可溶性表达水平低而限制其应用。糖基转移酶SL2能将天然产量高但苦味重的莱鲍迪苷A转化为天然产量低但苦味少的莱鲍迪苷d。本研究克隆... 详细信息

来自甜叶菊叶片的莱鲍迪苷d因其高甜度、低热量被认为是理想的天然甜味剂，又因其产量少、相关合成酶可溶性表达水平低而限制其应用。糖基转移酶SL2能将天然产量高但苦味重的莱鲍迪苷A转化为天然产量低但苦味少的莱鲍迪苷d。本研究克隆番茄来源莱鲍迪苷d相关合成酶UGTSL2基因，在大肠杆菌BL21（dE3）中进行重组表达，并通过单因素试验探究提高可溶性重组酶的表达水平。结果表明，重组酶在诱导温度为16 ℃、IPTG浓度为0.05 mmol·L-1、诱导时间为28 h时，在大肠杆菌BL21（dE3）中可溶性表达量最大。利用高效液相色谱法对反应体系进行分析，表明重组酶能够将莱鲍迪苷A成功转化为应用价值更高的莱鲍迪苷d。研究结果为后续可溶性重组酶固定化应用合成莱鲍迪苷d奠定良好基础，也为合成价值更高的莱鲍迪苷M提供前提支持。

关键词：糖基转移酶异源表达生物转化莱鲍迪苷d 莱鲍迪苷A