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荭草素和紫藤花黄酮富集物的抗糖尿病活性与作用机制研究

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荭草素和紫藤花黄酮富集物的抗糖尿病活性与作用机制研究

作者：周童曦中南民族大学

学位级别：硕士

Ⅱ型糖尿病(T2DM)是一种由遗传和环境因素之间相互作用影响的代谢紊乱综合征,预计到2030年将影响全球超过4亿的成年人,其特点是胰岛素调节和功能受损。胰岛素是一种重要的激素,在骨骼肌、脂肪组织和肝脏等组织中起到调节葡萄糖和脂质稳... 详细信息

Ⅱ型糖尿病(T2DM)是一种由遗传和环境因素之间相互作用影响的代谢紊乱综合征,预计到2030年将影响全球超过4亿的成年人,其特点是胰岛素调节和功能受损。胰岛素是一种重要的激素,在骨骼肌、脂肪组织和肝脏等组织中起到调节葡萄糖和脂质稳态的作用。在胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的情况下,胰岛素靶组织中的葡萄糖转运、糖原合成、糖异生及脂肪分解等功能缺陷,从而导致高血糖,这是T2DM的典型特征。目前治疗糖尿病的药物种类较多,但大多数药物都存在耐药性和副作用。因此,寻找更安全有效的抗糖尿病药物符合当今社会日益增长的需求。实验前期建立了胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞模型并用以评价IR状态下药物对细胞水平上糖代谢的影响。体外实验表明荭草素显著增强了细胞的葡萄糖摄取能力,增加了AMPK磷酸化水平及IRS-1蛋白的表达水平,并抑制了胰岛素抵抗诱导的IRS-1的丝氨酸(Ser)磷酸化。此外,Compound C(AMPK抑制剂)抑制了荭草素对胰岛素信号分子(包括p-IRS-1,IRS-1和GLUT-4)的调控,这说明荭草素诱导的AMPK的活化能调控胰岛素通路关键蛋白的表达。基因缺陷小鼠KK-Ay小鼠用于研究荭草素的体内抗糖尿病活性,口服荭草素可以有效缓解IR的症状包括异常升高的血糖水平、受损的口服糖耐量、高胰岛素血症和胰岛细胞功能失调。进一步利用蛋白印迹法检测胰岛素敏感性器官(肝脏和白色脂肪组织)中目的蛋白的表达,体内与体外的实验结果一致,即荭草素可以激活AMPK通路和胰岛素信号通路。此外,荭草素还可以减缓肥胖的进展并改善血脂异常、肝脂肪变性和脂肪细胞肥大的现象。为了阐明荭草素的抗肥胖作用,我们通过油红O染色实验证明了荭草素以剂量依赖性方式(2.5-10μM)抑制3T3-L1细胞内脂滴积累。q-PCR结合Western blotting分析结果表明荭草素能下调脂肪生成的转录因子和脂肪细胞特异性基因,并激活AMPK/ACC信号通路。同样的,在小鼠的白色脂肪和肝脏中,荭草素的治疗也促进了AMPK和ACC的磷酸化,减少了SREBP1-c的表达。综上,荭草素诱导的AMPK通路的激活可以维护糖脂代谢的稳态,荭草素发挥抗糖尿病作用主要来源于其对肥胖及胰岛素抵抗的抑制作用。葡萄糖转运子4(GLUT4)是人类基因组中编码的13种糖转运蛋白(GLUT1-GLUT12和HMIT)之一,它对于维持糖代谢稳态具有重要作用。GLUT4的表达在肌肉中受到精细的调节,这种调节对胰岛素刺激的葡萄糖摄取很关键。课题组前期建立了稳定表达IRAP-m Orange的大鼠骨骼肌L6细胞系,IRAP是间接反映GLUT4易位情况的报告分子,通过激光共聚焦显微镜观测细胞膜表面的荧光强度变化,可以高效筛选出能有效刺激GLUT4易位的活性药物。本实验中,紫藤花黄酮富集物(WS-FRE)显著促进GLUT4向质膜的转运。免疫印迹分析表明WS-FRE通过激活Akt和GLUT4以促进葡萄糖摄取。在体内,WS-FRE治疗4周后,小鼠的糖尿病典型症状包括高血糖、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、血脂异常等得到缓解。组织病理学分析显示,WS-FRE在一定程度上减轻了糖尿病小鼠的肝脏脂肪变性、脂肪细胞肥大和胰岛病变。免疫印迹结果显示,WS-FRE可抑制胰岛素靶组织IRS-1丝氨酸磷酸化,提高胰岛素靶组织PI3K p85、Akt磷酸化和GLUT4蛋白表达水平,提高外周组织胰岛素敏感性,从而改善糖尿病小鼠的糖代谢。WS-FRE的抗糖尿病作用可能与调节GLUT4、IRS-1丝氨酸磷酸化、PI3K磷酸化和Akt磷酸化有关。

关键词：抗糖尿病胰岛素抵抗荭草素紫藤花

荭草素抑制3T3-L1前脂肪细胞分化及其改善胰岛素抵抗的作用研究

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中国药理学通报 2017年第9期33卷 1221-1226页

作者：何彦峰李刚盖祥云林鹏程王洪伦青海民族大学药学院青海西宁810007 中国科学院西北高原生物研究所青海西宁810001

目的研究荭草素对3T3-L1前脂肪细胞分化及对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响,并探讨其作用机制。方法传统鸡尾酒法诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,MTT法检测荭草素对前脂肪细胞活力的影响,油红O染色法检测脂质积累,酶法检测细胞内甘油三酯(triglyce... 详细信息

目的研究荭草素对3T3-L1前脂肪细胞分化及对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响,并探讨其作用机制。方法传统鸡尾酒法诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,MTT法检测荭草素对前脂肪细胞活力的影响,油红O染色法检测脂质积累,酶法检测细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)的含量。地塞米松诱导成熟的脂肪细胞,建立胰岛素抵抗模型,荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose,2-NBDG)摄入法观察脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力;Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl Co A carboxylase,ACC)的磷酸化水平及葡萄糖转运体4(glucose transporter type 4,GLUT4)的表达水平,免疫荧光法检测GLUT4的向膜转位能力。结果荭草素可浓度依赖性地减少细胞脂滴的积累及细胞内TG的含量,但对细胞活力无明显的影响(P>0.05)。胰岛素抵抗状态下,荭草素明显增加脂肪细胞对2-NBDG的摄取(P荭草素抑制前脂肪细胞的分化,同时,荭草素通过上调AMPK/GLUT4信号途径相关蛋白的表达,促进了细胞对葡萄糖的摄取,达到改善胰岛素抵抗的作用。

关键词：荭草素 3T3-L1脂肪细胞分化胰岛素抵抗 p-ACC p-AMPK GLUT4

RP-HPLC测定注射用复方荭草冻干粉针中异荭草素、荭草素的含量

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中国药学杂志 2005年第14期40卷 1100-1102页

作者：兰燕宇王爱民何迅李勇军刘丽娜王永林贵阳医学院药学院贵州贵阳550004

目的建立注射用复方荭草冻干粉针中异荭草素、荭草素含量的RP—HPLC测定方法。方法色谱柱:Diamonsil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82),流速:1 mI·min-1,柱温:40℃;检测波长350 nm。结果被测定峰与其他组分... 详细信息

目的建立注射用复方荭草冻干粉针中异荭草素、荭草素含量的RP—HPLC测定方法。方法色谱柱:Diamonsil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82),流速:1 mI·min-1,柱温:40℃;检测波长350 nm。结果被测定峰与其他组分峰可达到基线分离,异荭草素、荭草素线性范围分别为0.049 6～0.794 0μg(r=0.999 9),0.031 6～0.506 0 μg(r= 0.999 9),回收率分别为98.4%,99.9%,RSD分别为2.2%,1.3%(n=9)。结论该法简便、准确、重现性好,适用于该制剂的质量控制。

关键词：反相高效液相色谱法复方荭草冻干粉针异荭草素荭草素

金莲花不同花部对荭草素和牡荆素的贡献度研究(英文)

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中国天然药物 2013年第6期11卷 699-704页

作者：袁铭王如峰刘莉嘉杨鑫彭玉帅孙震晓北京中医药大学中药学院北京100102

目的:建立一种评价不同花部对金莲花主要成分贡献度的综合方法,为金莲花的育种,培养,开发和利用提供依据。方法:重量分析法测定不同花部的质量分数,高效液相色谱法测定不同花部荭草素和牡荆素的含量,采用数学方法计算各花部对金莲花中... 详细信息

目的:建立一种评价不同花部对金莲花主要成分贡献度的综合方法,为金莲花的育种,培养,开发和利用提供依据。方法:重量分析法测定不同花部的质量分数,高效液相色谱法测定不同花部荭草素和牡荆素的含量,采用数学方法计算各花部对金莲花中荭草素和牡荆素的贡献度,并通过Kruskal-Wallis H检验和主成分分析对各花部的贡献度进行差异分析。结果:花萼、花冠、花蕊群、花柄和子房对荭草素和牡荆素的贡献度分别为76.99%和71.93%,9.60%和8.33%,9.21%和8.10%,2.17%和6.62%,2.03%和5.02%。结论:不同花部对荭草素和牡荆素的贡献不均等,其中,花萼贡献度最大,并且与其他花部具有极显著差异。

关键词：金莲花花部荭草素牡荆素

荭草素对于氧化应激状态下人支气管上皮细胞的作用及机制研究

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荭草素对于氧化应激状态下人支气管上皮细胞的作用及机制研究

作者：王玉南京医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:氧化应激是指机体在各种不利因素刺激下导致体内活性氧的蓄积,氧化与抗氧化失衡的一种状态,也是宿主对抗外界病原菌的先天性免疫反应重要的防御系统。但过度的氧化应激可能导致系统性的炎症反应和组织损伤[1-4]。相关研究表... 详细信息

背景和目的:氧化应激是指机体在各种不利因素刺激下导致体内活性氧的蓄积,氧化与抗氧化失衡的一种状态,也是宿主对抗外界病原菌的先天性免疫反应重要的防御系统。但过度的氧化应激可能导致系统性的炎症反应和组织损伤[1-4]。相关研究表明,氧化应激与肺部疾病(如COPD、哮喘等)有明确的关系[1、7、17、18]:(1)氧化剂可使中性粒细胞的变形能力减弱,促使其在微循环中聚集、活化,活化的中性粒细胞释放ROS,导致组织损伤;(2)氧化应激可以通过激活胞内信号通路(如:核因子-KB等)调节炎症介质的释放,活化中性粒细胞,进一步放大炎症损伤作用[5];(3)通过激活Rho蛋白,氧化应激可以引起巨噬细胞的重构,损伤巨噬细胞的功能,从而导致巨噬细胞不能正常清除病原体、异物及凋亡细胞等[6-7];(4)氧化应激可以导致组蛋白去乙酰化酶2活性降低,促使慢阻肺患者对糖皮质激素敏感性下降[8-9];(5)ROS产生增加可以诱导中性粒细胞释放蛋白酶,破坏肺组织弹性纤维,促使蛋白酶与抗蛋白酶失衡,导致肺气肿的发生。荭草素是传统中药竹叶的有效成分,属于黄酮类化合物[10]。荭草素作用广泛,具有显著的抗氧化,抗凋亡,镇痛,抗脂质形成和抗炎[11-16]等作用。其主要成分已投入临床使用的有荭叶通心软胶囊和荭草复方冻干粉制剂。氧化应激状态下荭草素对人支气管上皮细胞的研究尚不多见,本研究通过体外细胞学实验,应用过氧化氢刺激人支气管上皮细胞,给予不同浓度的荭草素干预,检测其对细胞存活率、凋亡率、形态学及相关蛋白表达情况,探讨氧化损伤时荭草素对人支气管上皮细胞的作用及机制。实验方法:1.人支气管上皮细胞(16HBE细胞)的培养:RPMI-1640培养基+10%胎牛血清,37℃、5%CO细胞培养箱中培养,2-3天传代一次;2.过氧化氢对16HBE细胞存活率的影响:用不同浓度(20、100、200uM)的HO攻击16HBE细胞2h,MTT检测细胞的存活率;3.不同浓度的荭草素(Orientin)干预后细胞存活率的变化:实验分为以下五组,空白对照组(细胞加培养基)、HO(200uM)、DMSO40uM、Orientin 5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、HO(200uM)+Orientin(5uM)、HO(200uM)+Orientin(10uM)、HO(200uM)+Orientin(40uM),干预的总时间均为 2h,MTT检测细胞存活率;4.荧光显微镜观察凋亡细胞形态变化:Hoechst33342对16HBE细胞凋亡染色观察细胞形态;***-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;*** Blot方法检测各组细胞Cleaved-caspase3/procaspase3凋亡蛋白的表达情况;7.酶标仪检测细胞内SOD(U/mg)的活力;***干预后对P-AKT/AKT通路的影响:提取细胞蛋白,Western Blot方法检测各组细胞P-AKT/AKT蛋白的表达水平。技术路线图:结果:1.16HBE细胞在不同浓度HO刺激下细胞的存活率:予以不同浓度(20、100、200uM)HO刺激16HBE细胞2h,以MTT法检测细胞存活率。与Con组(97.88±1.87%)相比,HO随着浓度的增加细胞存活率逐渐降低,20uM HO刺激16HBE细胞存活率为95.75±3.90%,无明显的统计学差异;100uM的HO浓度刺激时,细胞的存活率为75.86±1.01%,HO浓度达到200uM时,存活率降至57.76±2.10%,差别具有统计学意义(P＜0.05);因此,选择200uM HO作用16HBE细胞2h为诱导氧化应激的最佳浓度;***可以增加氧化应激下16HBE细胞的存活率:实验分为以下几组:空白对照组、HO(200uM)、DMSO40uM、Orientin5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、HO+Orientin(5uM)、HO+Orientin(10uM)、HO+Orientin(40uM),MTT法检测细胞存活率。DMSO40uM及Orientin(5uM、10uM、40uM)组和空白对照组相比均无统计学差异(图2)。HO组的细胞存活率与空白对照组相比,明显降低,差别具有统计学意义(P0.05)(图3、表2);***33342染色观察凋亡细胞形态学:荧光显微镜下观察空白对照组16HBE细胞活力

关键词：荭草素氧化应激人支气管上皮细胞凋亡

固相萃取-高效液相色谱法同时检测健康人血浆中的异荭草素、荭草素和灯盏乙素浓度

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中国临床药理学杂志 2007年第4期23卷 299-303页

作者：张颖高蕊刘建勋王书臣中国中医科学院西苑医院基础研究中心北京100091 中国中医科学院西苑医院临床药理中心北京100091

目的建立快速、准确、灵敏的分析方法检测3种主要活性黄酮成分:异荭草素、荭草素和灯盏乙素(抗冠心病药)在健康人体的血药浓度。方法健康人9例静脉滴注复方荭草冻干粉针后,选择固相萃取方法,在适当条件下一次提取3种成分,流动相:乙腈-... 详细信息

目的建立快速、准确、灵敏的分析方法检测3种主要活性黄酮成分:异荭草素、荭草素和灯盏乙素(抗冠心病药)在健康人体的血药浓度。方法健康人9例静脉滴注复方荭草冻干粉针后,选择固相萃取方法,在适当条件下一次提取3种成分,流动相:乙腈-四氢呋喃-磷酸缓冲液(pH=2)=9∶6∶85;柱温:40℃;流量:***-1;检测波长:340nm。结果异荭草素、荭草素和灯盏乙素与其他内源性和药源性成分达到良好分离,最低检测浓度分别达到5,5,***-1,平均回收率分别为93.0%,86.2%和97.5%。并能在17min内完成样品分析。结论该方法对3种检测成分可特异、准确、快速和灵敏的分析,可用于复方荭草冻干粉针在健康人的血药浓度分析。

关键词：异荭草素荭草素灯盏乙素药代动力学固相萃取-高效液相色谱法

HPLC-MS-MS同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷

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中国实验方剂学杂志 2012年第1期18卷 80-84页

作者：黄勇何峰张治蓉郑林兰燕宇王永林贵阳医学院药学院贵阳550004

目的:建立一种用于同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷3种黄酮成分的准确、灵敏的超高液相色谱-串联质谱分析方法,并研究其在大鼠体内的药代动力学。方法:大鼠静脉注射注射用复方荭草后,采用甲醇沉淀血浆蛋白,通过BEH C18柱分离... 详细信息

目的:建立一种用于同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷3种黄酮成分的准确、灵敏的超高液相色谱-串联质谱分析方法,并研究其在大鼠体内的药代动力学。方法:大鼠静脉注射注射用复方荭草后,采用甲醇沉淀血浆蛋白,通过BEH C18柱分离,乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱,采用电喷雾离子化三重四极杆串联质谱,以多反应监测(MRM)方式进行正离子检测。用于定量分析的二级碎片离子分别为449.2～329.2(荭草素)、433.2～313.0(牡荆素)和449.2～303.4(槲皮苷)。结果:3种黄酮成分在大鼠血浆中线性关系良好,日内、日间精密度(RSD)均荭草临床前药代动力学研究。

关键词：血浆大鼠荭草素牡荆素槲皮苷药动学超高液相色谱-串联质谱

HPLC测定不同采收期荭草中荭草素、异荭草素的含量

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中国实验方剂学杂志 2012年第2期18卷 62-64页

作者：窦妍翟延君佟苗苗张慧辽宁中医药大学药学院辽宁大连116600

目的:建立高效液相色谱法同时测定不同采收期荭草中荭草素、异荭草素含量的方法。方法:色谱柱为AgilentC18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱,检测波长350 nm,流速1.0 ***-1。结果:荭草素在0.068 2～0.682μg(r=0.99... 详细信息

目的:建立高效液相色谱法同时测定不同采收期荭草中荭草素、异荭草素含量的方法。方法:色谱柱为AgilentC18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱,检测波长350 nm,流速1.0 ***-1。结果:荭草素在0.068 2～0.682μg(r=0.999 7)线性关系良好,平均回收率为99.94%,RSD 1.08%;异荭草素在0.386～3.860μg(r=0.999 3)线性关系良好,平均回收率为99.67%,RSD 1.09%。结论:方法简便、快捷、准确的特点,可用于荭草药材的质量控制。

关键词：荭草荭草素异荭草素含量测定高效液相色谱法

HPLC法同时测定紫果西番莲叶中荭草素、异荭草素与牡荆素的含量

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中国药房 2011年第43期22卷 4075-4076页

作者：邹江冰黄木土蒋琳兰广州军区广州总医院药学部广州市510010

目的:建立同时测定紫果西番莲叶中荭草素、异荭草素与牡荆素含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Inertsil C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),检测波长为350nm,流速为1mL·min-1,柱温为30℃。结果... 详细信息

目的:建立同时测定紫果西番莲叶中荭草素、异荭草素与牡荆素含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Inertsil C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),检测波长为350nm,流速为1mL·min-1,柱温为30℃。结果:异荭草素、荭草素与牡荆素的检测浓度分别在0.015～0.150mg·mL-1(r=0.9998)、0.012～0.120mg·mL-1(r=0.9998)、0.012～0.120mg·mL-1(r=0.9994)范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系;平均回收率分别为99.04%(RSD=0.80%,n=6)、99.30%(RSD=1.03%,n=6)、98.92%(RSD=1.11%,n=6)。结论:本方法简便、准确,可为紫果西番莲叶的进一步开发利用提供质量控制依据。

关键词：紫果西番莲叶荭草素异荭草素牡荆素高效液相色谱法含量测定