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科学通报 1994年第9期39卷 847-849页

作者：雷向东宓怡德袁中一李载平吴祥甫中国科学院上海生物化学研究所上海200031

萤火虫荧光素酶Luciferase(EC1.***.12.7)在MgATP存在时,催化D-荧光素氧化脱羧,同时发出可见光,最大发射波长为562nm.总反应式如下:Luciferin+ATP+O_2(?)Oxyluciferin+AMP+PP_i+H_2O+hv医学中用荧光素酶测定ATP的含量,不仅简便、准确、而且灵敏,可以检测到10^(-14)mol/L水平的ATP.近年来分子生物学中应用荧光素酶基因作报道基因.应用现代检测仪器可以检测到10^(-19)mol的酶量,比检测CAT灵敏100—1000倍.

关键词：荧火素酶基因基因表达萤科家蚕

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一种体内检测ROP蛋白活性的方法及应用

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果树学报 2023年第10期40卷 2252-2262页

作者：张皓刘雪莹贺千可王鹏张绍铃吴巨友南京农业大学园艺学院·江苏省梨工程研究中心南京210095

【目的】建立一种体内检测ROP蛋白活性的方法,为进一步研究ROP蛋白的功能提供技术支持。【方法】该方法基于RIC作为ROP蛋白的效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点,通过荧火素酶互补试验,借助烟草瞬时表达系统,利用植物活体成像... 详细信息

【目的】建立一种体内检测ROP蛋白活性的方法,为进一步研究ROP蛋白的功能提供技术支持。【方法】该方法基于RIC作为ROP蛋白的效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点,通过荧火素酶互补试验,借助烟草瞬时表达系统,利用植物活体成像仪和酶标仪进行定性或定量检测荧光强度,从而实现体内检测ROP蛋白的活性。【结果】以拟南芥AtRIC1为检测基因,以AtROP1为例来检测其蛋白活性,成功检测到了AtROP1与AtRIC1有荧光,表明它们有互作。同时对AtROP1蛋白进行了点突变试验,成功构建了持续激活态的ROP1(AtROP1-CA)和持续失活态的ROP1(AtROP1-DN)载体,通过定性定量检测,发现与AtROP1-DN相比,AtRIC1与AtROP1-CA有更强的荧光信号,表明AtRIC1可以作为检测蛋白来检测AtROP1蛋白的活性。此外,通过引入3个蛋白(以AtGAP1、AtGDI1和AtGEF1蛋白为例),利用该方法进一步检测,表明AtGAP1和AtGDI1作为AtROP1蛋白活性的抑制因子,明显降低了AtROP1蛋白的活性;而AtGEF1作为AtROP1蛋白活性的促进因子,明显提高了AtROP1蛋白的活性,说明该方法还可以通过At-RIC1检测其他蛋白对AtROP1蛋白活性的影响。同时,该方法还解决了之前单一的pull-down试验检测ROP蛋白活性变化的问题,增加了一种新的体内检测ROP蛋白活性的方法。【结论】与其他方法相比,该方法具有高灵敏度、可视化、可定量化和操作简单等特点,并且适用于检测其他蛋白对ROP蛋白活性的影响,所以该方法是一种可靠的体内检测ROP蛋白活性的新方法。

关键词： ROP蛋白 RIC蛋白荧火素酶

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