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DC-SIGN荧光融合蛋白的构建、表达和生物学功能初探

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免疫学杂志 2006年第4期22卷 370-373页

作者：王靖雪张小萍贾正才耿淼吴玉章第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所重庆400038

目的构建绿色荧光蛋白(EGFP)标记的DCSIGN分子(DCSIGNEGFP融合蛋白),并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法PCR方法获得DCSIGN分子和EGFP分子的cDNA,分别克隆入真核表达载体pEGFPN1和真核表达载体pCI,使EGFP荧光蛋白分别位于DCSIGN蛋... 详细信息

目的构建绿色荧光蛋白(EGFP)标记的DCSIGN分子(DCSIGNEGFP融合蛋白),并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法PCR方法获得DCSIGN分子和EGFP分子的cDNA,分别克隆入真核表达载体pEGFPN1和真核表达载体pCI,使EGFP荧光蛋白分别位于DCSIGN蛋白的C末端和N末端。在转染COS7细胞后,在激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组分子的表达及融合蛋白在细胞定位情况。激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的功能情况。结果获得了预期的重组表达质粒,经DNA测序证实开放阅读框正确,转染COS7细胞后绿色荧光蛋白位于细胞膜,仅EGFP位于DCSIGNN末端的融合蛋白可被抗DCSIGN抗体结合。EGFP位于DCSIGNN末端的融合蛋白可有效摄取DCSIGN受体的高亲和力配体le(x)寡糖。结论所构建的DCSIGNEGFP融合蛋白在细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,可被抗DCSIGN抗体检测及摄取特异性配体,为进一步深入研究DCSIGN分子功能提供了良好的模型。

关键词： C-型凝集素DC-SIGN 荧光融合蛋白重组表达 le(x)寡糖

一种在植物细胞内共表达多种荧光融合蛋白的新方法及其在蛋白质极性转运与功能研究中的应用

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一种在植物细胞内共表达多种荧光融合蛋白的新方法及其在蛋白质极...

作者：钟桂涛华南农业大学

学位级别：硕士

蛋白质的亚细胞定位对于深入了解与研究其在细胞中的生理功能至关重要。将目标蛋白质与细胞内各细胞器和囊泡运输的报告蛋白进行共同表达时空分析,是一种方便且有效用于揭示目标蛋白的亚细胞定位和阐明其生物学功能的研究手段。传统的... 详细信息

蛋白质的亚细胞定位对于深入了解与研究其在细胞中的生理功能至关重要。将目标蛋白质与细胞内各细胞器和囊泡运输的报告蛋白进行共同表达时空分析,是一种方便且有效用于揭示目标蛋白的亚细胞定位和阐明其生物学功能的研究手段。传统的蛋白质共表达方法一般需要采用多个独立的蛋白表达载体来分别表达荧光融合蛋白,因此具有系列局限,其中包括:蛋白质共表达效率低、各载体表达水平有差异以及共表达转基因植株的获得需要转化、杂交和后续遗传筛选需时较长等缺点。在本研究中,我们建立了一个能够在植物中共表达多种荧光融合蛋白的新型高效的实验体系,并利用该体系来研究植物细胞内蛋白质极性转运的分子作用机理。首先,我们构建由多个半独立蛋白表达盒组成的表达载体,并在细胞中对该载体进行瞬时或稳定遗传表达,从而实现利用单一载体高效共表达多种荧光融合蛋白。为了验证该方法的可行性,我们分别在几种植物细胞中共同表达荧光融合的液泡分选受体和分泌载体膜蛋白。结果表明,它们的亚细胞定位与前人研究结果一致,说明该新实验体系完全有效可行。同时,与传统的植物蛋白共表达方法相比,这一新型的植物蛋白表达方法具有诸多优点。其每个蛋白质表达盒都含有各自独立的表达元件如启动子或终止子,可根据不同的蛋白质表达需求来进行灵活组合。此外,该方法中DNA片段的连接、蛋白质表达盒的组装和最终表达载体构建可以方便快捷地通过优化的一步法反应实现,无需额外酶切和连接反应。同时,它完全兼容目前基于荧光蛋白的生物成像技术和分析方法,如FRET和BiFC。同时,该新系统可以显著提高制备多蛋白共表达遗传转化植物的效率,缩短纯合体筛选所需时间。其次,利用该新型蛋白质共表达系统对植物细胞壁合成酶极性运输进的分子调控机制开展研究。植物细胞壁是植物细胞的重要结构,主要由纤维素和果胶,以及其他多糖和蛋白质等组成。这些细胞壁组分的形成需要多种细胞壁合成酶的参与,包括纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶。其中果胶甲酯酶NtPPME1在高尔基体中以囊泡形式分泌到细胞膜,纤维素合酶复合物和胼胝质合酶复合物通过反式高尔基网状体分泌的囊泡运输到细胞膜。然而,纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶极性分泌过程的分子作用机制尚未被研究清楚。我们利用新建立的蛋白共表达体系,以快速增长的花粉管细胞为实验材料,通过激光共聚焦电子显微镜技术探索纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶极性分泌与胞吐复合体之间的关系。

关键词：荧光融合蛋白瞬时表达稳定遗传转化植物细胞壁合成酶胞吐复合体

肿瘤相关基因MIP在HeLa细胞中的亚细胞定位及其变化

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解剖学报 2011年第2期42卷 175-179页

作者：叶晓霞霍克克陈东广东医学院组织学胚胎学教研室广东湛江524023 复旦大学生命科学院遗传研究所上海200433

目的探讨肿瘤相关基因MIP的亚细胞定位情况,以及MIP与其相互作用蛋白FASP1、MafF共转染HeLa细胞后亚细胞定位的变化和共定位情况。方法利用在线蛋白质结构和亚细胞定位分析软件,对MIP可能的蛋白结构和亚细胞定位进行分析预测;结合分析结... 详细信息

目的探讨肿瘤相关基因MIP的亚细胞定位情况,以及MIP与其相互作用蛋白FASP1、MafF共转染HeLa细胞后亚细胞定位的变化和共定位情况。方法利用在线蛋白质结构和亚细胞定位分析软件,对MIP可能的蛋白结构和亚细胞定位进行分析预测;结合分析结果,采用荧光蛋白融合表达和激光扫描共焦显微技术,观察比较MIP融合于绿色荧光蛋白(GFP)的N端或C端时在HeLa细胞中的亚细胞定位情况。pDsRed-FASP1、pDsRed-MafF分别单独转染,或者与MIP-GFP共同转染HeLa细胞,观察红色、绿色荧光蛋白的分布,分析比较各蛋白的亚细胞定位、变化及共定位情况。结果单独转染时,MIP主要呈不均匀点状分布于细胞质;GFP融合于MIP蛋白的N端或者C端,其亚细胞定位略有变化,MIP-GFP的不均匀分布更加典型,在胞质中呈点状聚集。DsRed-FASP1单独转染时弥散分布于细胞质;与MIP-GFP共同转染后,MIP与FASP1在细胞内的分布没有大的改变,两者能够共定位于细胞质。DsRed-MafF单独转染时弥散分布于细胞核;而与MafF-GFP共同转染时,两者的亚细胞定位均发生显著改变,此时两者能够共定位于细胞核内核仁区。结论 MIP能够与FASP1、MafF在细胞内不同部位相互作用。MIP在细胞质和细胞核中的定位变化,提示MIP可能作为一个重要的信号分子,在细胞质和细胞核中发挥多重作用。

关键词： MIP基因 FASP1 MaW 亚细胞定位荧光融合蛋白激光扫描共焦显微镜

原子力显微镜单分子力谱研究ICAM-1/CD11b相互作用及药物干预的影响

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军事医学 2019年第1期43卷 42-48页

作者：李贝贝孟荣英李屹刘惠亮安徽医科大学研究生学院合肥230032 解放军总医院第三医学中心心内科北京100039

目的利用绿色荧光蛋白(GFP)标记人细胞间黏附分子-1(ICAM-1),观察GFP是否影响ICAM-1在细胞膜表面的定位,实现ICAM-1可视化。应用原子力显微镜(AFM)单分子力谱研究ICAM-1/CD11b相互作用,并探讨瑞舒伐他汀(RSV)及单抗类药物干预的影响。... 详细信息

目的利用绿色荧光蛋白(GFP)标记人细胞间黏附分子-1(ICAM-1),观察GFP是否影响ICAM-1在细胞膜表面的定位,实现ICAM-1可视化。应用原子力显微镜(AFM)单分子力谱研究ICAM-1/CD11b相互作用,并探讨瑞舒伐他汀(RSV)及单抗类药物干预的影响。方法从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中提取总RNA,设计合成PCR引物(两端分别含有Bam HⅠ、HindⅢ特异性酶切位点),使用RT-PCR扩增获取ICAM-1cDNA编码区序列,经测序分析筛选正确序列,与pEGFP-N1表达载体相接,即得到基于GFP的重组质粒pICAM-1-GFP,脂质体介导转染COS-7细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白pICAM-1-GFP在COS-7上的定位。AFM单分子力谱测量该细胞模型上单对黏附分子ICAM-1/CD11b的相互作用力值,应用RSV及抗ICAM-1单克隆抗体干预,检测黏附力值是否有变化。结果序列分析RT-PCR扩增获得的片段为人ICAM-1的cDNA编码区,pICAM-1-GFP发出绿色荧光定位于COS-7细胞表面。单对黏附分子ICAM-1/CD11b的相互作用力值约为42pN,RSV干预对此值无明显影响,而抗ICAM-1单克隆抗体则有效降低了此单对黏附分子亲和力。结论荧光蛋白GFP能融合于ICAM-1的C端,且不影响ICAM-1在COS-7细胞膜表面的定位表达。RSV不能通过直接阻断单分子ICAM-1或CD11b影响其相互作用,可能是通过有效抑制ICAM-1表达量的增加从而发挥抗动脉粥样硬化炎症进程作用。抗ICAM-1单克隆抗体有效降低黏附分子亲和力,提示单抗类药物在抗炎治疗领域的应用前景。该研究建立的方法模型可作为活细胞体系探讨单对黏附分子亲和力及药物干预影响的重要研究手段。

关键词：细胞间黏附分子-1 绿色荧光蛋白荧光融合蛋白单分子力谱药物干预抗体,单克隆动脉粥样硬化降血脂药物

荧光共振能量转移技术阳性参照质粒的构建及应用

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山西医科大学学报 2015年第11期46卷 1074-1078页

作者：金艳燕邓君金良韵肖忠新徐志卿张进禄赵君朋薛冰首都医科大学医学实验与测试中心激光扫描共聚焦显微镜室北京100069 首都医科大学神经生物学系

目的构建青色荧光蛋白(CFP)基因和黄色荧光蛋白(YFP)基因相连接的真核表达载体pYFP-CFP,并检测融合蛋白CFP-YFP的FRET转移效率,为FRET技术提供阳性参照物。方法利用基因重组法,以带有CFP基因序列的质粒(p CFP)为模板,扩增CFP基因并插入... 详细信息

目的构建青色荧光蛋白(CFP)基因和黄色荧光蛋白(YFP)基因相连接的真核表达载体pYFP-CFP,并检测融合蛋白CFP-YFP的FRET转移效率,为FRET技术提供阳性参照物。方法利用基因重组法,以带有CFP基因序列的质粒(p CFP)为模板,扩增CFP基因并插入黄色荧光蛋白载体(pYFP)的多克隆位点中,构建真核表达质粒pYFP-CFP。经细胞转染后,使其表达CFP和YFP相连的融合蛋白。在激光共聚焦显微镜下采集FRET信号图和FRET转移效率(EFRET)的计算,并比较和分析表达CFP-YFP的阳性细胞与CFP和YFP共表达的阴性细胞。结果真核表达质粒pYFP-CFP构建成功,并在细胞质中表达,这与p CFP和pYFP共转染的细胞中荧光蛋白的分布略有不同,后者在细胞胞质和细胞核中均有表达。统计结果显示表达融合蛋白的阳性组EFRET明显高于共表达的阴性组,差异有统计学意义。结论融合荧光蛋白分子的青色和黄色蛋白之间具有10个氨基酸残基相连,符合FRET现象发生的条件,能够采集到很强的FRET信号,可作为FRET研究的稳定阳性实验参照。

关键词：质粒构建荧光共振能量转移转移效率荧光融合蛋白