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荧光蛋白标记研究进展

草业学报 2019年第10期28卷 209-216页

作者：杨晓玫姚拓师尚礼甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室甘肃兰州730070 甘肃省草业工程实验室中-美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃兰州730070

荧光蛋白标记由于其独特的颜色感官,在医学、遗传育种和草地植被抗病中占有重要的位置。荧光蛋白分子标记的选择与方法与其特异性的DNA有关,基因的结构是荧光蛋白标记、进行基因交流和促进基因表达的重要部分。荧光蛋白标记技术主要包... 详细信息

荧光蛋白标记由于其独特的颜色感官,在医学、遗传育种和草地植被抗病中占有重要的位置。荧光蛋白分子标记的选择与方法与其特异性的DNA有关,基因的结构是荧光蛋白标记、进行基因交流和促进基因表达的重要部分。荧光蛋白标记技术主要包括热激转导和电击转化两种不同的类型,需通过大肠杆菌作为载体结合菌株,不影响其任何生物功能,是目前大分子示踪检测及研究定殖的主要方法,研究荧光蛋白标记对病原菌和根际促生菌的定殖和良好利用优良菌株有着重要意义。但是,荧光蛋白标记是在分子水平,对研究的方法增加了难度。根据目前国内外已有的部分荧光蛋白标记研究,评述了标记的原理,标记的适用性以及标记的不同方法等内容,并展望了不同标记方法对利用荧光蛋白的可能性,以期为研究荧光蛋白标记提供系统的方法参考和技术借鉴。

关键词：荧光蛋白分子标记标记方法适用性展望

猕猴桃间座壳菌Diaporthe actinidiae的绿色荧光蛋白基因标记及侵染过程

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菌物学报 2022年第3期41卷 450-458页

作者：冯丹丹邓蕾苏琦雅刘德江钟彩虹李黎中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室中国科学院猕猴桃产业技术工程实验室中国科学院种子创新研究院中国科学院武汉植物园湖北武汉430074 佳木斯大学生命科学学院黑龙江佳木斯154007

果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌。该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究。本... 详细信息

果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌。该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究。本研究采用PEG介导原生质体转化的技术,运用携带GFP及潮霉素抗性基因的双元载体pCAMBgfp对D.actinidiae菌株进行遗传转化。首先,对转化子进行潮霉素及绿色荧光筛选,随后进行菌落的生物学特征观察、荧光稳定性验证及致病力检测,最终得到3株菌丝形态、生长速度及致病力与野生型菌株一致的稳定荧光菌株。将KFDA-17转化子接种于贮藏期猕猴桃果实‘金梅’,1 d后果实出现水渍症状,随后出现软腐症状且逐步加重;发病部分菌丝体在荧光显微镜下呈现明显的绿色荧光,可清晰观察侵染进程。本研究成功构建了PEG介导的间座壳菌丝体的原生质体遗传转化体系,且KFDA-17荧光菌株可用于侵染过程研究。

关键词：猕猴桃软腐病荧光蛋白遗传转化转化子致病力

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荧光蛋白及其在微生物过程工程中的应用

食品与发酵工业 2019年第17期45卷 252-257页

作者：毛洪丽刘雨张建国上海理工大学医疗器械与食品学院食品科学与工程研究所

荧光蛋白是一系列在紫外光激发下产生荧光的发光蛋白,以其荧光稳定性好、灵敏度高、无毒害等优点广泛应用于诸多领域。目前成功开发的荧光蛋白有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein,B... 详细信息

荧光蛋白是一系列在紫外光激发下产生荧光的发光蛋白,以其荧光稳定性好、灵敏度高、无毒害等优点广泛应用于诸多领域。目前成功开发的荧光蛋白有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluoroscent protein,CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。荧光蛋白在微生物工程中菌株筛选方面的应用逐渐成熟,菌株筛选是菌种工程中较为耗时、费力的步骤,荧光蛋白为菌株筛选提供了新突破口。本文从荧光蛋白的基础研究出发,综述了近年来荧光蛋白在微生物工程中菌株筛选方面的进展和基于荧光蛋白的新型微生物筛选技术,为荧光蛋白等其他发光蛋白在微生物菌种工程的应用提供参考。

关键词：荧光蛋白菌种工程筛选策略微流体技术

荧光蛋白标记逆转录病毒整合酶及Brd2真核表达载体的构建

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中国病原生物学杂志 2018年第7期13卷 699-703页

作者：汪速飞杨梓艺魏巍余冰李雨蔓倪明华中科技大学同济医学院病原生物学系湖北武汉430030 华中科技大学同济医学院口腔医学专业湖北武汉430030 华中科技大学同济医院感染科湖北武汉430030

目的构建绿色荧光蛋白标记的莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)整合酶及红色荧光蛋白标记的Brd2的真核表达质粒,为研究整合酶与Brd2相互作用打下基础。方法以Prr88-MLV、HIV质粒pNL4-3及含有Brd2的质粒为模板,采用PCR技... 详细信息

目的构建绿色荧光蛋白标记的莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)整合酶及红色荧光蛋白标记的Brd2的真核表达质粒,为研究整合酶与Brd2相互作用打下基础。方法以Prr88-MLV、HIV质粒pNL4-3及含有Brd2的质粒为模板,采用PCR技术扩增MLV-IN、HIV-IN、Brd2片段;利用酶切反应体系构建psectag2A-GFP-mIN、psectag2A-GFP-hIN、pDsred2-N1-Brd2质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳后进行测序分析;用重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察目的蛋白表达情况,并进行WB鉴定。结果构建psectag2A-GFP-hIN、psectag2AGFP-mIN、pDsred2-N1-Brd2的真核表达质粒,酶切以及测序结果与预期相符。将上述质粒分别转染293T细胞,WB及荧光显微镜均检测到目的蛋白的表达。结论成功构建了绿色荧光标记的HIV、MLV整合酶真核表达质粒和红色荧光蛋白标记的Brd2真核表达质粒,尽管Brd2真核表达质粒荧光相对较弱,但这对整合酶与Brd2相互作用研究奠定了基础。

关键词：莫洛尼鼠白血病病毒人类免疫缺陷病毒整合酶溴结合蛋白(Brd2) 荧光蛋白

表达双色荧光蛋白的RAW264.7单克隆细胞株的构建及鉴定

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中华口腔医学杂志 2016年第9期51卷 552-557页

作者：任蕾王永强 Michael Glogauer 中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙周科·广东省口腔医学重点实验室广州510055 Matrix Dynamics Group Faculty of Dentistry The University of TorontoToronto Canada

目的利用慢病毒载体（pVSVG）构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株及其功能鉴定,以期实时检测它们在破骨细胞形成过程中的表达及动态变化.方法利用pVSVG构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株,采用激光扫描共聚焦显微... 详细信息

目的利用慢病毒载体（pVSVG）构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株及其功能鉴定,以期实时检测它们在破骨细胞形成过程中的表达及动态变化.方法利用pVSVG构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株,采用激光扫描共聚焦显微镜活细胞成像技术连续动态观察RAW264.7细胞在NF-κB受体激活蛋白配体诱导下向破骨细胞形成的过程.采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP）及4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色对表达磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）与超正电荷的RAW264.7细胞株及破骨细胞进行功能鉴定.结果联合转染的RAW264.7细胞株形态为圆形或椭圆形,为正常生长形态,且保留了良好的破骨细胞分化能力.超正电荷绿色荧光蛋白（＋ 8-greenfluorescent protein,＋8-GFP）主要表达在RAW细胞的质膜上,分布均匀;当破骨细胞形成后,＋8-GFP在质膜上的荧光强度明显减弱;PS表达在RAW细胞的质膜上,但在破骨细胞形成后,PS不仅表达在质膜上,同时也分布在细胞质和细胞器上.活细胞成像观察发现破骨细胞融合可发生在贴壁状态下及单核与单核、单核与多核及多核与多核细胞之间,最终形成巨大的多核破骨细胞,因此破骨细胞的融合具有反复性.结论成功构建可同时表达双色荧光蛋白的单克隆细胞株,为在三维空间进一步研究膜融合过程中的各种蛋白质和其他分子的构象改变,以及它们之间的相互作用方式提供了平台.

关键词：破骨细胞荧光蛋白超正电荷磷脂酰丝氨酸

结构导向的可逆光激活绿色荧光蛋白探针的研制

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光学学报 2017年第3期37卷 15-24页

作者：王盛陈轩泽常蕾薛瑞莹孙育杰北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室北京100871 北京大学生物动态光学成像中心北京100871 北京大学生命科学学院北京100871

近几年,可逆光激活荧光蛋白的研制越来越受到人们的重视,这类荧光蛋白极大地促进了活细胞超高分辨显微成像技术的发展及应用。可逆光激活荧光蛋白可被不同波长的光多次可逆地进行调制,因而被广泛地应用于高密度数据的光存储、光致变色... 详细信息

近几年,可逆光激活荧光蛋白的研制越来越受到人们的重视,这类荧光蛋白极大地促进了活细胞超高分辨显微成像技术的发展及应用。可逆光激活荧光蛋白可被不同波长的光多次可逆地进行调制,因而被广泛地应用于高密度数据的光存储、光致变色荧光共振能量转移的测量以及基于可逆饱和线性荧光跃迁原理的超高分辨率显微成像中。从研制这类荧光蛋白所涉及的关键氨基酸位点出发,本文综述了近几年可逆光激活绿色荧光蛋白的研制进展,并简要地讨论荧光蛋白结构与光学特性的关系,从而为后续结构导向的可逆光激活荧光蛋白的研制提供参考。

关键词：显微光学显微术可逆光激活荧光蛋白超分辨成像荧光探针绿色荧光蛋白

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荧光蛋白传感器领域的科技创新先锋

科技成果管理与研究 2022年第10期17卷 16-19页

作者：王佩佩不详

蛋白质是生物界一类重要的生物大分子,其种类有10^(10)~10^(12)种。荧光蛋白是一类特殊的蛋白质,能够在生物体中发光,表现出良好的生物相容性和基因编码性,可应用到生物成像领域进行细胞质一细胞核的动力学研究。而荧光蛋白传感器是一... 详细信息

蛋白质是生物界一类重要的生物大分子,其种类有10^(10)~10^(12)种。荧光蛋白是一类特殊的蛋白质,能够在生物体中发光,表现出良好的生物相容性和基因编码性,可应用到生物成像领域进行细胞质一细胞核的动力学研究。而荧光蛋白传感器是一种基于荧光蛋白进行生物体信号探测的生物型传感器,通过对表达蛋白标记,实现细胞活动的可视化观测,从而进一步深入开展蛋白质组学的相关研究。特别是在癌症的研究过程中,荧光蛋白为科学家观测肿瘤细胞的具体活动提供了可能。

关键词：荧光蛋白传感器领域信号探测蛋白质组学生物成像生物大分子生物相容性蛋白标记

维普期刊数据库评论

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绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

复旦学报（自然科学版） 2019年第2期58卷 183-190页

作者：胡业辉李益鹏王紫英陈勖任真丁澦复旦大学生命科学学院生理学与生物物理学系上海200438

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原... 详细信息

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.

关键词：荧光蛋白绿色荧光蛋白结合蛋白纳米抗体蛋白表达蛋白纯化微量热泳动

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荧光蛋白的拉曼光谱研究及其结构与功能解析

荧光蛋白的拉曼光谱研究及其结构与功能解析

作者：袁也华中农业大学

学位级别：硕士

荧光蛋白是现代生物学研究中的重要标记工具之一。科学家们基于已有发色团结构及荧光蛋白发光机理,已经获得了许多光学性质优良的荧光蛋白。就深层组织成像而言,所使用的荧光蛋白需要具有良好的单体性质,较高量子产率、较快的成熟时间,... 详细信息

荧光蛋白是现代生物学研究中的重要标记工具之一。科学家们基于已有发色团结构及荧光蛋白发光机理,已经获得了许多光学性质优良的荧光蛋白。就深层组织成像而言,所使用的荧光蛋白需要具有良好的单体性质,较高量子产率、较快的成熟时间,其荧光光谱应该更加靠近650 nm至1100 nm的“近红外光学窗口”。然而,目前尚无同时满足这些要求的近红外荧光蛋白。为了能够更加理性的进化出性能优良的近红外荧光蛋白,我们仍需要聚焦荧光蛋白的发色团结构及其微环境。拉曼光谱是分子振动、转动状态的“指纹图谱”,生物大分子的拉曼光谱可以反应诸多分子结构信息。为此,本文深入研究了EGFP系列荧光蛋白(EGFP、ECFP、EYFP)和mNeptune及其突变体的拉曼光谱,创新性地将荧光蛋白的特征拉曼谱峰、发色团结构特征及其光学性质之间建立了关联,提出了影响荧光蛋白发射波长发生位移的可能性机制,具体如下:1.获得EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱,观察到C=N谱峰变化,这是因为EGFP和ECFP的N与H2O形成氢键,并且N通过该氢键从HO吸电子,相比于不存在该氢键作用的EYFP,这种吸电子效应造成C=N谱峰红移。而EGFP中该氢键作用比ECFP更强,其具有更强的吸电子效应,因此,EGFP的C=N谱峰相比于ECFP更加红移。2.EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱中,发现C=C谱峰位置与其最大吸收波长之间存在良好的直线关系,表明C=C的拉曼位移与荧光蛋白激发能之间存在激发能越小,C=C拉曼谱峰红移的现象。同样的,在mNeptune系列红色荧光蛋白中也发现类似现象,该现象产生的原因还需要进一步进行科学合理地解释。3.获得mNeptune系列红色荧光蛋白的拉曼光谱,发现mNeptune684的66Tyr苯酚环相关的拉曼谱峰变化的现象,相比于mNeptune,1170、1400蓝移到1176、1416 cm,1156 cm由于蓝移被1176 cm覆盖。这是因为在mNeptune684中,158N和143N形成协同的氢键作用,通过该作用对C-O及66Tyr的苯环产生吸电子效应,降低了66Tyr苯酚环的电子密度,造成其相关的拉曼谱峰同时发生蓝移。这是158N和143N协同的氢键作用对mNeptune系列荧光蛋白拉曼光谱产生改变的最直接的证据之一。基于此,预计在未来的近红外荧光蛋白往光谱更加红移的方向进化时,采用类似的方法产生更多协同的氢键作用,进一步拓展发色团的共轭平面。本研究不仅为荧光蛋白发色机理、波长红移等光学性质的阐释提供了重要理论依据,同时为荧光蛋白的体外进化提供了指导性的结构信息。此外,本研究进一步拓展了拉曼光谱在生物大分子结构研究中的应用。

关键词：拉曼光谱荧光蛋白近红外 mNeptune