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大鼠细胞外信号调节激酶1基因3'非编码区双荧光素酶报告载体的构建及rno-miR-15b-5p对其活性的影响

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中国康复理论与实践 2017年第2期23卷 166-172页

作者：罗汉将徐云峰李晓晓杨予涛徐志卿首都医科大学基础医学院北京市100069 黄岛出入境检验检疫局山东青岛市266555

目的以大鼠细胞外信号调节激酶1(ERK1)基因3'非编码区(UTR)为研究对象,构建含有ERK1基因3'UTR区的野生型以及突变型重组双荧光素酶报告载体,通过分析双荧光素酶报告载体的活性,明确rno-miR-15b-5p对报告载体的调节作用。方法采用miRNeas... 详细信息

目的以大鼠细胞外信号调节激酶1(ERK1)基因3'非编码区(UTR)为研究对象,构建含有ERK1基因3'UTR区的野生型以及突变型重组双荧光素酶报告载体,通过分析双荧光素酶报告载体的活性,明确rno-miR-15b-5p对报告载体的调节作用。方法采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的总RNA,以PC12细胞的c DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)将ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。利用重叠延伸PCR,将ERK1基因3'UTR中的rno-miR-15b-5p潜在的靶序列TGCTGCT分别突变成CGAACGT和GTACACG,并将突变的ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。结果成功构建了包含ERK1基因3'UTR区的野生型报告载体pmiR-ERK1 3'UTR和突变型报告载体pmiR-ERK1-mut 3'UTR。利用荧光素酶活性检测系统,发现rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型报告载体的活性(P活性。结论成功构建ERK1基因3'UTR区野生型和突变型双荧光素酶报告载体,初步证明ERK1基因3'UTR区是rno-miR-15b-5p的结合靶点。

关键词： rno-miR-15b-5p 细胞外信号调节激酶1 重叠延伸聚合酶链式反应 pmiR-ERK1 3'UTR pmiR-ERK1-mut 3'UTR 荧光素酶活性检测

食管癌细胞Ezrin基因转录调控区克隆及其启动子活性的鉴定

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中华肿瘤防治杂志 2008年第23期15卷 1764-1767页

作者：高书颖许丽艳崔磊郭张燕蔡唯佳孟令英李恩民汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室广东汕头515041 汕头大学医学院肿瘤病理研究室广东汕头515041

目的:克隆食管癌侵袭转移相关基因Ezrin的转录调控区序列,进行启动子活性鉴定及初步的生物信息学分析。方法:利用在线程序对Ezrin基因可能的转录调控区进行GC含量和CpG岛分析以及转录因子结合位点预测;采用PCR法从食管癌细胞基因组DNA... 详细信息

目的:克隆食管癌侵袭转移相关基因Ezrin的转录调控区序列,进行启动子活性鉴定及初步的生物信息学分析。方法:利用在线程序对Ezrin基因可能的转录调控区进行GC含量和CpG岛分析以及转录因子结合位点预测;采用PCR法从食管癌细胞基因组DNA中克隆Ezrin基因-1759/+134和-726/+134区段,构建萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGLB-hE(-1759/+134)和pGLB-hE(-726/+134),检测所克隆片段的启动子活性。结果:Ezrin基因5′侧翼区为高GC含量区,存在CpG岛,无典型的TATA盒,然而转录因子Sp1结合位点却无处不在。与对照质粒pGLB相比,重组质粒pGLB-hE(-726/+134)具有较强的荧光素酶活性,pGLB-hE(-1759/+134)的荧光素酶活性约是pGLB-hE(-726/+134)的2倍。结论:Ezrin基因的-726/+134区段具有启动子活性,含有Ezrin基因的核心启动子区和调节性启动子区;-1759/-726区段具有增强启动子活性的作用,含有Ezrin基因增强子元件区。

关键词：食管肿瘤基因,ezrin 基因表达调控荧光素酶活性检测

TAP26磷酸化对SP-C基因表达调控影响的研究

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中国妇幼保健 2009年第31期24卷 4443-4446页

作者：邓飞涛叶伦柴新群华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科湖北武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科

目的:探讨TTF-1相关蛋白26(TAP26)磷酸化位点对SP-C基因表达调控的影响。方法:采用定点诱变PCR技术产生TAP26的4个磷酸化位点突变体TAP26(S48→A48)、TAP26(S66→A66)、TAP26(T167S168→V167A168)、TAP26(T219→V219);通过体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究野生型TAP26及其4个突变体质粒对SP-C基因启动子表达活性的影响。结果:荧光素酶报告基因活性值检测结果显示,分别与共转染野生型TAP26和其它3个突变体质粒相比较,共转染TAP26(S66→A66)突变体质粒的荧光素酶活性值最低,经统计分析差异均有统计学意义(P<0.05,n=9)。结论:TAP26磷酸化对促进SP-C基因表达具有非常重要的作用,TAP-26的S66位点则是与TTF-1相互作用从而共同调控SP-C基因表达的一个关键PKC磷酸化位点。

关键词： TAP26 TTF-1 SP-C基因启动子定点诱变PCR 荧光素酶活性检测

siRNA干扰ERK1/2表达对食管癌细胞ezrin基因的转录调控作用

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肿瘤防治研究 2010年第5期37卷 491-494页

作者：高书颖李恩民陆晓峰杜则澎许丽艳汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室 515041 深圳北京大学香港科技大学医学中心汕头大学医学院肿瘤病理研究室

目的检测siRNA干扰细胞外信号调节激酶ERK1/2基因表达对ezrin基因的转录调控作用,探讨食管癌细胞ezrin基因的表达调控机制。方法采用定量RT-PCR技术,检测转染ERK1/2siRNA对食管癌EC109细胞ERK1/2和ezrin基因mRNA表达水平的影响;采用双... 详细信息

目的检测siRNA干扰细胞外信号调节激酶ERK1/2基因表达对ezrin基因的转录调控作用,探讨食管癌细胞ezrin基因的表达调控机制。方法采用定量RT-PCR技术,检测转染ERK1/2siRNA对食管癌EC109细胞ERK1/2和ezrin基因mRNA表达水平的影响;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测siRNA干扰ERK1/2表达对EC109细胞ezrin基因启动子活性的影响。结果在食管癌EC109细胞中,转染ERK1/2siRNA,降低ERK1/2和ezrin基因的mRNA表达水平以及ezrin基因启动子活性。结论 ERK1/2对食管癌细胞ezrin基因的转录具有调控作用。

关键词： ezrin基因食管癌细胞定量RT-PCR 细胞外信号调节激酶1/2 荧光素酶活性检测

PLAGL2、TTF-1对SP-C基因启动子的共同调控作用

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中国妇幼保健 2009年第25期24卷 3576-3579页

作者：邓飞涛柴新群华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科湖北武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科

目的:探讨多形性腺瘤样基因2(PLAGL2)和甲状腺转录因子-1(TTF-1)对表面活性蛋白C(SP-C)基因启动子的共同调控作用。方法:应用定点诱变技术和体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究PLAGL2、TTF-1对SP-C基因启动子表达活性... 详细信息

目的:探讨多形性腺瘤样基因2(PLAGL2)和甲状腺转录因子-1(TTF-1)对表面活性蛋白C(SP-C)基因启动子的共同调控作用。方法:应用定点诱变技术和体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究PLAGL2、TTF-1对SP-C基因启动子表达活性的影响及相互作用;应用实时荧光PCR技术检测PLAGL2、TTF-1及SP-C在人胚肺和成熟小鼠肺Ⅱ型上皮细胞中的表达。结果:荧光素酶报告基因活性值检测结果显示TTF-1、PLAGL2共转染后所测SP-C基因启动子荧光素酶活性值明显低于PLAGL2共转染后SP-C基因启动子的活性值(P荧光素酶活性值明显低于其突变体质粒转染后的活性值(P荧光PCR检测结果显示,PLAGL2基因的表达水平随胚肺发育成熟而逐渐减少,TTF-1和SP-C基因的表达水平则逐渐增高。结论:在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2和TTF-1对SP-C基因共同调控的过程中体现出一种动态平衡、相互抑制的关系。

关键词： PLAGL2 TTF-1 SP—C基因启动子定点诱变PCR 荧光素酶活性检测实时荧光PCR

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

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肿瘤防治研究 2009年第9期36卷 721-725页

作者：高书颖李恩民崔磊孟令英杜则澎许丽艳汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室广东汕头515041 汕头大学医学院肿瘤病理研究室广东汕头515041

目的鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。方法采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69,相对于转录起始位点)和AP-1结... 详细信息

目的鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。方法采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69,相对于转录起始位点)和AP-1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。结果在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP-1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50%左右;同时置换Sp1结合位点和AP-1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。结论HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP-1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。

关键词： ezrin基因基本启动子电泳迁移率变动分析定点突变荧光素酶活性检测

PLAGL2对TTF-1结合SP-C基因启动子能力影响的研究

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医学分子生物学杂志 2012年第4期9卷 262-266页

作者：邓飞涛葛凉芳杨昀李彦旭柴新群华中科技大学附属协和医院妇产科武汉市430022 华中科技大学附属协和医院肝胆外科武汉市430022

目的研究甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor1，TTF-1）对表面活性蛋白C（pulmonary surfactant—asso—ciated protein C，SP-C）基因启动子的调控作用及多形性腺瘤样基因2（pleiomorphic adenoma gene like-2，PLAGL2）对TTF-1结合SP-C基因启动子能力影响。方法应用体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究TTF-1对SP-C基因启动子转录活性的调控及PLAGL2的影响作用：利用凝胶电泳迁移实验（EMSA）研究TTF-1对SP-C基因启动子靶点的结合及PLAGL2的影响作用：应用实时荧光PCR技术检测PLAGL2、TTF-1、SP—C在人胚肺和成熟小鼠肺Ⅱ型上皮细胞中mRNA水平。结果TTF-1明显提高SP—C基因启动子荧光素酶活性值（P〈0.01）。而共转染PLAGL2后则明显降低SP—C基因启动子荧光素酶活性值（P〈0．01）；TTF-1能与同位素标记的SP—C基因启动子片段结合形成TTF-1-SP-CDNA蛋白复合物，PLAGL2则明显降低该蛋白复合物形成；TTF-1、SP-C基因mRNA水平随胚肺孕周逐渐升高，PLAGL2基因mRNA水平随胚肺孕周逐渐减少。结论在肺Ⅱ型细胞中TTF-1对SP—C基因表达具有促进作用，PLAGL2则对该作用产生明显抑制影响。

关键词：多形性腺瘤样基因2 甲状腺转录因子-1 SP-C基因启动子荧光素酶活性检测凝胶电泳迁移实验实时荧光PCR

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

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井冈山大学学报（自然科学版） 2019年第3期40卷 31-34,55页

作者：杨潮何小杨莫淑芳戴京张欣宇陈慧赣南师范大学生命科学学院

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过... 详细信息

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。

关键词： WDR79 启动子克隆荧光素酶活性检测

PLAGL2对SP-C基因表达的调控及其机制的初步研究

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中国优生与遗传杂志 2008年第3期16卷 33-35,44页

作者：邓飞涛柴新群吴超英王泽华华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科武汉430022

目的研究多形性腺瘤样因子2(pleiomorphic adenoma gene like-2,PLAGL2)对肺表面活性蛋白C基因(surfactant protein-C,SP-C)表达的影响及调控机制。方法通过定点诱变技术分别突变掉SP-C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6?7... 详细信息

目的研究多形性腺瘤样因子2(pleiomorphic adenoma gene like-2,PLAGL2)对肺表面活性蛋白C基因(surfactant protein-C,SP-C)表达的影响及调控机制。方法通过定点诱变技术分别突变掉SP-C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6?7位锌指结构域并获得相应的突变体;利用细胞共转染和荧光素酶报告基因检测技术研究PLAGL2对SP-C基因启动子表达活性的影响及比较正常及突变体的PLAGL2或SP-C基因启动子之间相互作用的差异以明确PLAGL2对SP-C基因的调控及作用靶点。结果细胞共转染试验中,荧光素酶活性检测结果表明PLAGL2可明显增加SP-C基因的表达(P活性的增高与PLAGL2的作用浓度呈正相关;当定点诱变掉PLA-GL2的第6或7位锌指结构域后,PLAGL2的突变体质粒均不能增高SP-C基因的表达活性,与对照组相比较,差异具有显著性(P活性,与对照组相比较,两者具有明显差异(P<0·01)。结论在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2通过其第6和7位锌指结构域结合于SP-C基因启动子上的PLAGL2结合位点序列来促进SP-C基因的表达。

关键词：多形性腺瘤样因子2 表面活性蛋白C基因定点诱变细胞共转染荧光素酶活性检测