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桔小实蝇BdorOBP2对甲基丁香酚及其结构类似物的结合分析

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环境昆虫学报 2024年第2期46卷 480-488页

作者：钟耿军高旭渊申建梅何沐阳梁康源张金玟潘月云苏湘宁章玉苹胡黎明仲恺农业工程学院植物健康创新研究院广州510225 广西作物病虫害生物学重点实验室/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室南宁530007 广东省农业科学院植物保护研究所广州510640

本文研究了桔小实蝇Bactrocera dorsalis气味结合蛋白BdorOBP2对甲基丁香酚(ME)及其结构类似物的结合特性,以期为基于蛋白结构的新型引诱剂的分子设计提供靶标蛋白。本研究扩增获得气味结合蛋白BdorOBP2基因并进行序列分析。三维结构预... 详细信息

本文研究了桔小实蝇Bactrocera dorsalis气味结合蛋白BdorOBP2对甲基丁香酚(ME)及其结构类似物的结合特性,以期为基于蛋白结构的新型引诱剂的分子设计提供靶标蛋白。本研究扩增获得气味结合蛋白BdorOBP2基因并进行序列分析。三维结构预测显示,BdorOBP2具有6个α螺旋,同时含有6个保守的半胱氨酸残基。荧光定量结果表明BdorOBP2在雌雄虫触角中的表达水平最高,同时在足、翅等组织中表现出性别差异表达特性,推测BdorOBP2具有识别性信息素和寄主挥发物的双重作用。在对BdorOBP2蛋白表达和纯化的基础上,采用荧光竞争结合试验分析了BdorOBP2与甲基丁香酚及其类似物的结合能力,结果显示BdorOBP2蛋白对丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚甲醚等4种化合物的结合能力相当。BdorOBP2在感受寄主挥发物及性信息素过程中挥发重要作用,为基于靶标蛋白的新型行为调控剂的分子设计提供了重要参考。

关键词：桔小实蝇气味结合蛋白荧光竞争结合试验甲基丁香酚类似物

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、原核表达及其结合特性

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中国农业科学 2019年第20期52卷 3705-3712页

作者：李玲谭瑶周晓榕庞保平内蒙古农业大学草原昆虫研究中心

【目的】沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础... 详细信息

【目的】沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp(GenBank登录号MK250532),其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框(ORF)全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8μmol·L-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55μmol·L-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29μmol·L-1。【结论】沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。

关键词：沙葱萤叶甲气味结合蛋白 RACE克隆原核表达荧光竞争结合试验

小菜蛾触角结合蛋白PxylABP结合模式的研究

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华北农学报 2016年第5期31卷 233-238页

作者：邓培渊袁伟李玉华王林青李长看郑州师范学院生物物种资源研究中心河南郑州450044 华北水利水电大学环境与市政工程学院河南郑州450045

为了研究触角结合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)的生理功能,利用RT-PCR方法克隆了小菜蛾Pxyl ABP基因,并在大肠杆菌中表达,纯化的重组蛋白通过荧光竞争结合试验测定其与29种化合物的结合特性,并运用Auto Dock 4.2进行Pxyl ABP... 详细信息

为了研究触角结合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)的生理功能,利用RT-PCR方法克隆了小菜蛾Pxyl ABP基因,并在大肠杆菌中表达,纯化的重组蛋白通过荧光竞争结合试验测定其与29种化合物的结合特性,并运用Auto Dock 4.2进行Pxyl ABP蛋白和化合物的分子对接。结果表明,Pxyl ABP与异硫氰酸丙烯酯、己醛、己烷、2-己酮、吲哚和β-紫罗兰酮结合,解离常数分别为0.91,1.81,1.17,2.71,2.74,14.95μmol/L;分子对接显示,Tyr100与异硫氰酸丙烯酯形成1个氢键。说明Pxyl ABP参与了小菜蛾识别十字花科蔬菜和虫害诱导的植物挥发物的生理过程。

关键词：小菜蛾触角结合蛋白荧光竞争结合试验分子对接

大草蛉化学感受蛋白基因CpalCSP3组织表达谱及气味结合特性分析

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棉花学报 2015年第3期27卷 260-267页

作者：王思豹张帅雒珺瑜李兆群吕丽敏王春义崔金杰董双林南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室南京210095 中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000

昆虫化学感受蛋白（Chemosensory protein,CSP）具有结合和运载气味分子穿过感器淋巴液到达嗅觉受体的作用,但尚未见有关大草蛉（Chrysopa pallens）CSP功能的报道。本研究克隆得到大草蛉Cpal CSP3基因,利用RT-q PCR技术测定了其在成虫... 详细信息

昆虫化学感受蛋白（Chemosensory protein,CSP）具有结合和运载气味分子穿过感器淋巴液到达嗅觉受体的作用,但尚未见有关大草蛉（Chrysopa pallens）CSP功能的报道。本研究克隆得到大草蛉Cpal CSP3基因,利用RT-q PCR技术测定了其在成虫各组织的表达谱,发现Cpal CSP3基因主要在雌雄虫的触角和头部表达,暗示该基因参与了大草蛉的嗅觉及味觉感受。为探讨其嗅觉功能,利用原核表达系统和荧光竞争结合试验测定了Cpal CSP3蛋白与84种气味物质的结合能力。结果表明,Cpal CSP3蛋白与橙花叔醇、（＋）￣雪松醇和β￣紫罗兰酮具有很高的结合能力,结合常数（Ki）为8.79-9.79μmol·L-1;与根皮苷、月桂醛、乙酸香叶酯和α￣蒎烯也有较高的结合能力,Ki为11.54-19.06μmol·L-1。分析认为,Cpal CSP3蛋白可能在大草蛉对这些气味的嗅觉感受中起作用,使得大草蛉能对害虫寄主植物有效定向进而搜寻到猎物。

关键词：大草蛉化学感受蛋白组织表达谱原核表达荧光竞争结合试验

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP33配体结合特性

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中国生物防治学报 2020年第2期36卷 203-210页

作者：孙小洁李仔博张强刘运泽郑方强张永军山东农业大学植物保护学院泰安271018 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

本文研究了绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP33的配体结合特性,以期明确其在绿盲蝽化学感受过程中的生理功能。基于前期绿盲蝽触角转录组测序数据,筛选获得候选气味结合蛋白AlucOBP33。三维结构预测显示,AlucOBP33由6个α螺旋构成,包含3对保... 详细信息

本文研究了绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP33的配体结合特性,以期明确其在绿盲蝽化学感受过程中的生理功能。基于前期绿盲蝽触角转录组测序数据,筛选获得候选气味结合蛋白AlucOBP33。三维结构预测显示,AlucOBP33由6个α螺旋构成,包含3对保守的半胱氨酸,属于classic OBPs。室内对AlucOBP33基因进行了克隆和重组表达,采用荧光竞争结合试验研究了重组AlucOBP33蛋白与潜在的73种挥发性气味及13种味觉化合物的结合特性。结果显示,AlucOBP33重组蛋白能够分别与2种醇类、4种酮类、1种酯类、1种醛类和1种烯烃类的挥发性气味以及4种非挥发性化合物结合,推测AlucOBP33在绿盲蝽嗅觉感受和味觉识别过程中发挥双重功能。

关键词：绿盲蝽气味结合蛋白荧光竞争结合试验化学感受

棉蚜化学感受蛋白AgosCSP2的基因克隆、时空表达动态及气味结合特征分析

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棉花学报 2014年第3期26卷 228-236页

作者：李娜张帅雒珺瑜吕丽敏崔金杰李国清南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室江苏南京210095 中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000

化学感受蛋白是一类存在于昆虫化学感受器中的可溶性蛋白,可能与昆虫识别外界化学信息有关。本研究从棉蚜(Aphis gossypii)转录组数据中克隆得到1条编码化学感受蛋白的cDNA序列,命名为AgosCSP2(GenBank登录号KC017751)。使用qRT-PCR技... 详细信息

化学感受蛋白是一类存在于昆虫化学感受器中的可溶性蛋白,可能与昆虫识别外界化学信息有关。本研究从棉蚜(Aphis gossypii)转录组数据中克隆得到1条编码化学感受蛋白的cDNA序列,命名为AgosCSP2(GenBank登录号KC017751)。使用qRT-PCR技术对此化学感受蛋白mRNA在棉蚜中的时空表达谱进行了分析,结果表明AgosCSP2在多数类型棉蚜若虫中的表达量明显高于成虫中的表达量;在寄主为棉花时的表达量高于寄主为木槿时;在无翅成蚜中足的表达量相对其他组织较高。荧光竞争性结合试验表明AgosCSP2与气味化合物的结合能力较弱。推测该基因主要参与棉蚜若虫对寄主的适应过程,具有嗅觉以外的生理功能。试验结果为进一步研究AgosCSP2的功能奠定了基础。

关键词：棉蚜化学感受蛋白表达谱原核表达纯化荧光竞争结合试验

甜菜夜蛾化学感受蛋白SexiCSP2结合特性和机理研究

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植物保护 2021年第5期47卷 118-125页

作者：邓培渊王林青袁洪哲李长看郑州师范学院生物物种资源研究中心郑州450044

为阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua化学感受蛋白识别外源化合物的特性和作用机制,运用Western blotting法分析SexiCSP2蛋白在成虫各组织的表达谱,荧光竞争结合试验法测定SexiCSP2蛋白与25种外源配基的结合特性,运用分子对接、分子动力学... 详细信息

为阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua化学感受蛋白识别外源化合物的特性和作用机制,运用Western blotting法分析SexiCSP2蛋白在成虫各组织的表达谱,荧光竞争结合试验法测定SexiCSP2蛋白与25种外源配基的结合特性,运用分子对接、分子动力学、结合自由能计算等方法研究SexiCSP2与配基的结合模式。结果显示SexiCSP2在成虫接触和非接触性器官中均有表达,与己醛结合能力最强,解离常数为1.3μmol/L;分子模拟结果显示SexiCSP2与己醛结合形成1个氢键,两者结合自由能为-32.94 kJ/mol,主要驱动力为范德华力,主要抑制力为非极性溶剂化能。这些结果说明SexiCSP2在甜菜夜蛾识别外源化合物中起重要作用,可以作为防控甜菜夜蛾的有效靶标。

关键词：甜菜夜蛾化学感受蛋白 Western blotting 荧光竞争结合试验分子动力学

小菜蛾触角结合蛋白PxylOBP31的鉴定与结合特性分析

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昆虫学报 2016年第8期59卷 812-822页

作者：覃江梅蔡立君郑丽双程小娟尤民生福建农林大学应用生态研究所福州350002 闽台特色作物病虫生态防控协同创新中心福州350002 农业部闽台作物有害生物综合治理重点实验室福州350002 福建农林大学植物保护学院福州350002 福建农林大学生命科学学院福州350002

【目的】触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)为昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)家族的一个亚类,是昆虫识别和响应外界环境中气味信号的载体之一,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确触角结合蛋白在小菜... 详细信息

【目的】触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)为昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)家族的一个亚类,是昆虫识别和响应外界环境中气味信号的载体之一,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确触角结合蛋白在小菜蛾Plutella xylostella(L.)嗅觉识别中的作用,有助于揭示小菜蛾嗅觉识别分子机制。【方法】利用PCR技术克隆小菜蛾的一个触角结合蛋白基因;采用实时荧光定量PCR技术对该基因在小菜蛾不同发育阶段和成虫不同组织中的表达量进行分析;利用荧光竞争结合实验测试该触角结合蛋白与39种配基化合物的结合特性。【结果】成功克隆了一个小菜蛾触角结合蛋白基因,命名为Pxyl OBP31(Gen Bank登录号:KT156676)。序列分析结果显示,其开放阅读框全长411 bp,编码136个氨基酸,N端自起始位置开始21个氨基酸为信号肽,含有气味结合蛋白家族的6个保守半胱氨酸残基,预测分子量为14.74 k D,等电点为4.41。表达谱分析表明,Pxyl OBP31主要在雄蛾中表达,且交配后的雄蛾中表达量明显降低;该基因在小菜蛾触角中有较高表达,在雄蛾触角中的表达量比雌蛾触角中高近2倍。结合特性实验结果显示,Pxyl OBP31与醛、酮、萜品油烯以及邻苯二甲酸二异丁酯等物质的结合能力较强,与3种性信息素及其他烯烃与酯类结合能力弱。【结论】本研究明确了Pxyl OBP31的核苷酸序列以及发育和组织表达谱。根据qRT-PCR和荧光竞争结合实验结果,推测Pxyl OBP31蛋白可能与小菜蛾觅偶、定位寄主植物等行为有关。

关键词：小菜蛾气味结合蛋白触角结合蛋白基因克隆表达谱荧光竞争结合试验

大螟两个气味结合蛋白基因的体外表达及配体结合能力分析

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大螟两个气味结合蛋白基因的体外表达及配体结合能力分析

作者：刘岩南京农业大学

学位级别：硕士

在漫长的进化过程中,昆虫特别是蛾类昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统,并以此感受外界环境中各种气味物质,从而做出相应的生理或行为反应,如寻找配偶、栖息场所以及躲避天敌等。触角是昆虫最重要的嗅觉器官,蛾类昆虫的触角高度发达,着生有... 详细信息

在漫长的进化过程中,昆虫特别是蛾类昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统,并以此感受外界环境中各种气味物质,从而做出相应的生理或行为反应,如寻找配偶、栖息场所以及躲避天敌等。触角是昆虫最重要的嗅觉器官,蛾类昆虫的触角高度发达,着生有大量的嗅觉感器。在昆虫的外周神经系统,嗅觉的完成依赖于嗅觉感器内的多种蛋白,其中气味结合蛋白(Odorant Binding Protein,OBP)高浓度存在于嗅觉感器的腔内,其功能被认为是结合并运送脂溶性气味物质穿过感器腔到达感受神经元膜嗅觉受体(OdorantReceptor,OR)部位,然后气味分子激活嗅觉受体。研究重要农业害虫的OBP及其功能,不仅有助于深入理解昆虫的嗅觉机制,还能为开发基于嗅觉的害虫行为调控技术提供潜在靶标。大螟Sesamia infeens属鳞翅目夜蛾科,是水稻上的重要害虫。为了探讨大螟的嗅觉机制,本研究在课题组前期有关基因鉴定和组织表达谱分析的基础上,选取2个触角高表达的OBP基因进行原核表达,然后利用荧光竞争结合试验,测定了 2个OBP和不同植物气味的结合能力,主要结果如下:1.大螟OBP15的原核表达及配体结合能力的分析大螟OBP15基因在触角中高表达,推测在嗅觉中起作用。首先利用原核表达系统对该基因进行体外表达和纯化:把OBP基因构建到pET-30a(+)载体中,把正确的重组质粒转入大肠杆菌感受态中,用终浓度为1 mM的IPTG进行诱导表达6 h,经SDS-PAGE检测发现该重组蛋白主要在大肠杆菌的包涵体中表达。经过蛋白复性、肠激酶切和亲和层析纯化等过程,得到大小为14KD左右的目的纯化蛋白。得到纯化蛋白后,用1-NPN作为荧光探针,利用荧光竞争结合分析的方法,测定了大螟OBP15对35种水稻气味物质的结合能力。结果发现,OBP15纯化蛋白对被测气味物质均没有明显的结合能力(Ki>50μM),有待扩大气味物质的筛选范围,找到和OBP15有较强结合能力的气味物质。2.大螟ABPX的原核表达及配体结合能力分析触角结合蛋白(Antennal binding protein,ABP)隶属于OBP家族,其功能研究相对较少。课题组前期研究发现,大螟ABPx在成虫触角中高表达,本文利用体外技术对其功能进行了探索。首先利用原核表达系统在大肠杆菌中对该蛋白进行了大量表达和纯化,得到预期大小(14 KD左右)的目的蛋白。然后以1-NPN位探针,利用荧光竞争结合试验的方法,测定了 ABPx对35种不同结构的气味物质配体的结合能力。结果显示,在被测35种气味中,大螟ABPx只与β-紫罗兰酮有一定的结合能力(Ki=35.58μM)。由此推测该ABPx可能在大螟对β-紫罗兰酮的感受中起作用,但并不排除在未检测到的其他气味的感受中起作用。

关键词：大螟原核表达气味结合蛋白荧光竞争结合试验