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荧光相关光谱单分子检测系统的研究

分析化学 2005年第7期33卷 899-903页

作者：张普敦任吉存上海200240 上海交通大学化学化工学院上海交通大学环境科学与工程学院上海交通大学环境科学与工程学院

基于激光共焦构型,构建了一套高灵敏度和高稳定性的荧光相关光谱单分子检测系统。采用高数值孔径物镜使激光束高度聚焦,并用同一物镜收集样品的荧光,单光子计数器用于实时记录荧光信号。优化系统保持物镜焦点、针孔以及单光子计数器光... 详细信息

基于激光共焦构型,构建了一套高灵敏度和高稳定性的荧光相关光谱单分子检测系统。采用高数值孔径物镜使激光束高度聚焦,并用同一物镜收集样品的荧光,单光子计数器用于实时记录荧光信号。优化系统保持物镜焦点、针孔以及单光子计数器光敏区高度同轴。采用60×1.2(NA)的水浸物镜及直径为160μm的针孔得到的检测系统结构参数为ω0和z0分别为0.42μm和1.33μm,照射微区的体积为1.3fL。单个RhodamineGreen分子可获得13倍的信噪比。用该系统获得了小分子和生物大分子(DNA片段和蛋白质)的高质量荧光相关图谱,成功实现了单个分子的检测。

关键词：荧光相关光谱单分子检测分子扩散

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荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展

分析化学 2005年第6期33卷 875-880页

作者：张普敦任吉存上海200240 上海交通大学化学化工学院上海交通大学化学化工学院环境科学与工程学院

单分子检测在生命科学、化学、物理学等领域具有重要的意义。荧光相关光谱是单分子检测的新技术,在生命科学领域有巨大的应用潜力。综述了荧光相关光谱单分子检测的原理、实验技术以及在生物分子相互作用、活细胞、核酸、疾病诊断、高... 详细信息

单分子检测在生命科学、化学、物理学等领域具有重要的意义。荧光相关光谱是单分子检测的新技术,在生命科学领域有巨大的应用潜力。综述了荧光相关光谱单分子检测的原理、实验技术以及在生物分子相互作用、活细胞、核酸、疾病诊断、高通量筛选以及与毛细管电泳联用等领域的研究,并展望了其发展前景。

关键词：单分子检测荧光相关光谱评述

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应用荧光相关光谱测定L-色氨酸的浓度

光谱学与光谱分析 2018年第8期38卷 2451-2455页

作者：顾颂朱焯炜马超群陈国庆江南大学理学院江苏无锡214000 江苏省轻工光电工程技术研究中心江苏无锡214000

应用FLS920P型荧光光谱仪对L-色氨酸溶液进行三维荧光光谱检测,从中发现:L-色氨酸的特征荧光峰位于270/350nm。设定发射波长为350nm,测量激发谱。由测量结果发现在250~260nm区间,谱线斜率较大、线性度好。因此选取250,255和260nm三个激... 详细信息

应用FLS920P型荧光光谱仪对L-色氨酸溶液进行三维荧光光谱检测,从中发现:L-色氨酸的特征荧光峰位于270/350nm。设定发射波长为350nm,测量激发谱。由测量结果发现在250~260nm区间,谱线斜率较大、线性度好。因此选取250,255和260nm三个激发波长,在每个激发波长下分别测量相应的荧光发射谱。基于三条不同的荧光发射谱,构建以激发波长为外扰变量的自相关光谱;而以浓度为外扰变量的自相关光谱,是以超纯水在不同激发波长的平均谱作为参考光谱,通过参考光谱与样本平均谱的相关计算得到。在此基础上,将相关光谱数据分别与偏最小二乘回归(PLSR)和径向基神经网络(RBFNN)相结合,建立溶液中L-色氨酸含量的预测模型,研究结果表明:采用浓度为外扰变量构造的荧光相关光谱信噪比较高,建模的预测效果要好;而在外扰变量相同时,基于径向基神经网络建立的预测模型比基于偏最小二乘回归建立的预测模型对溶液中L-色氨酸浓度的预测结果更为准确。其中,以浓度为外扰变量时的径向基神经网络预测模型准确度最高,该模型的预测相关系数为99.91%,预测均方根误差为0.033μg·mL^(-1)。研究结果表明,使用该方法能够对溶液中的物质含量进行准确测定,可为食品安全监管提供帮助。

关键词： L-色氨酸荧光相关光谱偏最小二乘回归径向基神经网络

荧光相关光谱法直接测定溶液中金纳米粒子浓度

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分析科学学报 2018年第4期34卷 496-500页

作者：刘芳超董朝青任吉存上海交通大学化学化工学院上海200240

本文利用金纳米粒子(AuNPs)的荧光特性,采用荧光相关光谱建立了溶液中AuNPs摩尔浓度测定的新方法。实验优化了激光强度和采样时间等实验条件。在优化的条件下检测,微区内的粒子数与AuNPs浓度具有良好线性关系。该方法成功地用于合成的... 详细信息

本文利用金纳米粒子(AuNPs)的荧光特性,采用荧光相关光谱建立了溶液中AuNPs摩尔浓度测定的新方法。实验优化了激光强度和采样时间等实验条件。在优化的条件下检测,微区内的粒子数与AuNPs浓度具有良好线性关系。该方法成功地用于合成的溶液中AuNPs摩尔浓度的测定,测定结果与传统的方法基本一致。该方法与现有方法相比,具有灵敏高、快速简便、样品和试剂用量少、样品无损等特点,不仅可以用于溶液中AuNPs浓度的测定,而且有望应用于活细胞内AuNPs的实时原位分析。

关键词：荧光相关光谱金纳米粒子浓度荧光

最大熵法分析寡聚核苷酸链内碰撞的荧光相关光谱(英文)

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物理化学学报 2010年第4期26卷 1087-1092页

作者：尹延东周晓雪赵新生北京大学化学与分子工程学院化学生物学系分子动态与稳态结构国家重点实验室北京分子科学国家实验室北京100871

准确地由荧光相关光谱(FCS)的实验数据提取动力学信息一直是一个挑战.本文对比了三种主要的方法:依赖于模型的多指数函数法,经验的拓展指数函数法和不依赖于模型的最大熵法.多指数函数法的物理意义直接但在复杂体系中难以应用和解释.拓... 详细信息

准确地由荧光相关光谱(FCS)的实验数据提取动力学信息一直是一个挑战.本文对比了三种主要的方法:依赖于模型的多指数函数法,经验的拓展指数函数法和不依赖于模型的最大熵法.多指数函数法的物理意义直接但在复杂体系中难以应用和解释.拓展指数函数法简单易行但其物理意义含混不清.最大熵法不依赖于具体的物理模型但拟合结果对实验噪音很敏感.经研究我们发现一个好的选择是将最大熵法和多指数函数法结合在一起使用.对寡聚核苷酸链内碰撞荧光相关光谱的研究发现,在单链DNA中可以形成碱基对时,有两个并行的链内碰撞反应.以前的拓展指数函数法分析则不能提供这样的信息.我们建议在荧光相关光谱研究中审慎地使用最大熵法.

关键词：荧光相关光谱弛豫时间分布拓展指数函数最大熵法寡聚核苷酸光致电子转移

基于FPGA的实时荧光相关光谱三元数字相关器的设计与实现

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激光与光电子学进展 2024年第9期61卷 419-427页

作者：孙亚楠蔡萍王伟达陆欣伟董朝青任吉存上海交通大学电子信息与电气工程学院仪器科学与工程系上海200240 上海交通大学化学化工学院上海200240

面向荧光相关光谱分析应用,研究基于现场可编程逻辑门阵列(FPGA)技术的多通道实时荧光相关光谱三元数字相关器的实现方法。硬件结构基于寄存器级硬件描述语言设计和实现。基于荧光相关光谱的特点,采用多采样时间相关和模块“分时复用”... 详细信息

面向荧光相关光谱分析应用,研究基于现场可编程逻辑门阵列(FPGA)技术的多通道实时荧光相关光谱三元数字相关器的实现方法。硬件结构基于寄存器级硬件描述语言设计和实现。基于荧光相关光谱的特点,采用多采样时间相关和模块“分时复用”的设计思想,有效减少了运算量和硬件资源消耗。将二元相关的分时复用思想扩展至三元相关,提出了适用于三元相关的分时复用方法,实现了基于FPGA的实时计算的三元数字相关器。通过对称归一化的计算方法保证了相关函数的计算精度。光子相关器基于Xilinx Zynq-7100 FPGA芯片实现,实现了三路自相关、三路互相关和一路三元相关的实时计算。实验验证了相关计算的准确性,最高时间分辨率可达40 ns,动态范围为1.57×10^(7)。

关键词：荧光相关光谱数字相关器多采样时间相关法光子脉冲计数分时复用

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荧光相关光谱均相免疫新方法研究

荧光相关光谱均相免疫新方法研究

作者：汤理川上海交通大学

学位级别：硕士

免疫分析是利用抗原与抗体之间高特异性的反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。免疫分析是一种非常重要的生物分析方法,它被广泛地应用于临床诊断,食品和环境分析,生物及医学研究等领域。目前免疫分析主要以微孔板为实... 详细信息

免疫分析是利用抗原与抗体之间高特异性的反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。免疫分析是一种非常重要的生物分析方法,它被广泛地应用于临床诊断,食品和环境分析,生物及医学研究等领域。目前免疫分析主要以微孔板为实验平台的异相分析模式。这种方法需要包埋、冲洗等多步操作。因此,这种方法操作繁琐,分析时间长,不能满足某些快速检测和诊断的要求。近年来,均相免疫分析以其快速便捷的操作和低廉的成本,受到越来越多的关注。然而,由于这种方法的灵敏度较低,不能满足高背景噪音的临床检测要求。本文旨在利用贵金属纳米颗粒合成生物探针,并结合荧光相关光谱,发展了一种高灵敏的均相免疫分析新方法。主要研究工作包括如下两个方面: 1、银纳米颗粒（SNP）具有很强的共振散射光,并对荧光染料有信号增强的效果,是性能优良的标记分子。但是其在均匀性与稳定性上的劣势阻碍了它的应用。本文采用巯基十一烷基酸（MUA）对银纳米颗粒进行了表面修饰,有效地改善了它的均匀性与稳定。并通过控制抗体与银纳米颗粒的物质的量比例（2:1与10:1）,实现了银纳米颗粒的生物连接,合成了低抗体-银纳米结合物与高抗体-银纳米结合物。同时,本文还利用共振光散射相关光谱（RLSCS）,对银纳米颗粒及其表面修饰和生物连接过程进行了表征研究,并优化了实验条件。通过与其他表征结果的比较,证明RLSCS是一种表征银纳米颗粒的有效的单分子检测手段。 2、本文选择甲胎蛋白抗原（AFP）与其抗体（AFP1A6）作为实验模型进行均相免疫研究,并利用Alexa Fluor 647标记的AFP作为均相竞争免疫的示踪抗原。低抗体-银纳米结合物和高抗体-银纳米结合物分别与抗原进行免疫反应而成的免疫复合物,同自由的染料标记抗原相比,扩散时间分别增加了60倍（低抗体银纳米探针）与120倍（高抗体银纳米探针）。同时,这些免疫产物的荧光强度分别增加了18倍与49倍,信噪比也增加了10倍与20倍。基于银纳米颗粒在荧光增强与扩散时间增加上的作用,本文结合双组分荧光相关光谱,发展了纳米银增强荧光相关光谱均相竞争免疫分析方法。在优化的条件下,这种方法具有良好的灵敏度,其检测限为1.5 pM,线性范围从6 pM至60 pM（R＞0.99）。在人体血清AFP水平的测试中,检测的相对标准偏差（RSD）约为5%,回收率大于90%。从而实现了均相免疫在实体生物样品中应用的目标。综上所述,利用纳米银增强荧光相关光谱方法进行的免疫分析,不仅能够提高抗原与免疫结合物的区分度,而且能够显著的增加免疫分析的灵敏度。这一技术必将在临床诊断、食品与环境分析以及生物和生物医药等研究领域展现其巨大的发展潜力。

关键词：银纳米颗粒荧光相关光谱荧光增强均相免疫分析甲胎蛋白

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荧光相关光谱研究三链DNA形成热力学

荧光相关光谱研究三链DNA形成热力学

作者：胡红燕上海交通大学

学位级别：硕士

DNA或RNA寡核苷酸能特异性识别双链DNA位点,形成三链DNA,这种识别为体内及体外基因结构和功能修饰提供了有效方法。三链DNA的形成可导致基因表达位点的特异性调节,蛋白质结合的调节,DNA缺陷的识别,突变和同源重组的增强,从而成为基因特... 详细信息

DNA或RNA寡核苷酸能特异性识别双链DNA位点,形成三链DNA,这种识别为体内及体外基因结构和功能修饰提供了有效方法。三链DNA的形成可导致基因表达位点的特异性调节,蛋白质结合的调节,DNA缺陷的识别,突变和同源重组的增强,从而成为基因特异性的操控工具。此外,三链DNA技术广泛应用在分子生物学和生物化学中,用于将药物递送到DNA损伤的特定部位,为序列特异性地标记DNA双链,识别和纯化DNA,研究复杂DNA蛋白质的相互作用等。目前三链DNA研究方法主要包括紫外吸收光谱方法、等温滴定量热法、电泳法、圆二色性(CD)光谱等。然而,这些方法灵敏度低、试剂用量大、不能用于原位检测。本文中基于荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,简称FCS)技术,提出了一种高灵敏、微体积三链DNA分析新方法。我们系统地研究了三链DNA中单链与双链的相互作用以及三链DNA形成的稳定性。主要包括以下两部分工作:1.我们首先以Cy5标记的单链DNA探针和70 bp双链DNA为反应模型,利用荧光相关光谱系统地研究了三链DNA形成条件。我们发现在0.1m M精胺(spermine)和150m M的氯化钾(KCl)存在时,三链DNA具有较好的稳定性。然后,我们研究了单链DNA的长度、溶液的p H对三链DNA稳定性的影响。我们发现随单链DNA长度增加三链DNA的稳定性会增加。溶液的p H对三链的稳定性有一定的影响。我们发现15-mer T碱基形成的三链DNA最佳的p H在6.5,而15-mer混合碱基形成的三链DNA最佳p H在6.0。进而,我们测定了不同温度下三链DNA的结合常数(Ka),获得了三链DNA形成的吉布斯自由能(35)G<0,(35)S=33((cal/mol)K-1),(35)H=-4.09(kcal/mol)。最后,我们设计了20-mer单链DNA探针,以146 bp双链DNA(为人的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因)为模型,我们尝试了将FCS方法用于双链DNA单碱基突变检测的可能性。我们发现FCS方法能够区分完全匹配的单链DNA探针和三条单碱基错配的单链DNA探针与146 bp双链DNA的杂交比例。我们的实验结果表明FCS方法非常适合于三链DNA的形成和稳定性研究,是区别三链DNA的单碱基错配热稳定性差异的一个有效工具。2为了进一步扩宽FCS方法在三链DNA研究中应用,我们研究了Ag+对三链DNA稳定性的影响。我们以Cy5标记的15 mer T ss DNA探针与70 bp ds DNA以及Cy5标记的20 mer ss DNA探针与146 bp ds DNA为模型,研究了Ag+浓度和p H对三链DNA稳定性的影响。实验结果表明,在Cy5标记的15 mer T ss DNA探针与70 bp ds DNA三链反应体系中,低浓度的Ag+对三链DNA有较弱的稳定作用;较高Ag+浓度将会减小三链DNA的稳定性。在Cy5标记的20 mer ss DNA探针与146 bp ds DNA反应体系中,Ag+会降低三链DNA的稳定性。

关键词：三链DNA 荧光相关光谱结合常数吉布斯自由能

荧光相关光谱法对量子点与蛋白质结合的温度和pH依赖性的热力学研究

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荧光相关光谱法对量子点与蛋白质结合的温度和pH依赖性的热力学研...

作者：赵启燕青岛大学

学位级别：硕士

由于测量具有很高的灵敏度、测量时不破坏研究体系的平衡状态以及可以进行实时监测等优点,荧光相关光谱(FCS)技术在化学、生命科学等领域得到越来越广泛的应用,特别是在生物化学领域内对原位测量显示出独有的优势。量子点由于特殊的尺... 详细信息

由于测量具有很高的灵敏度、测量时不破坏研究体系的平衡状态以及可以进行实时监测等优点,荧光相关光谱(FCS)技术在化学、生命科学等领域得到越来越广泛的应用,特别是在生物化学领域内对原位测量显示出独有的优势。量子点由于特殊的尺寸和优异的物理化学性能,在生物化学领域吸引了越来越多的关注。当量子点被引入到蛋白质或细胞中后,它们可以被许多的蛋白质包覆而形成一个蛋白质外壳,称为“蛋白质冕”。这样,被包被了蛋白质的量子点就有了更好的生物相容性,有利于量子点的生物应用和毒性研究。因此本文基于荧光相关光谱法,研究了典型的荧光纳米材料─CdSe/ZnS水溶性羧基量子点,对生物大分子的相互结合的温度和pH的依赖性,并进行了量子点与蛋白质结合的热力学分析;并且通过圆二色谱法和模拟计算得到了CdSe/ZnS水溶性羧基量子点与蛋白质之间可能的结合位点和可能的结合方式。基于荧光相关光谱技术探究了原位条件下不同基团包覆的CdSe/ZnS水溶性点与血浆和血清的结合程度,实现了在缓冲液以及纯血清和纯血液的原位环境下对FCS的应用。探究了金和银纳米颗粒对不同浓度BSA包覆的不同厚度的CdSe/ZnS水溶性羧基量子点的荧光寿命的影响,即相对作用距离对CdSe/ZnS水溶性羧基量子点的荧光寿命的影响。结果表明随着BSA对CdSe/ZnS水溶性羧基量子点的包覆厚度增大,CdSe/ZnS水溶性羧基量子点的荧光寿命都向短波长方向移动;短寿命物种的比例从14.75%增加到28.93%,长寿命物种的比例从85.25%减少到71.07%。该研究课题对于量子点的生物原位应用和毒性研究有重要意义。

关键词：荧光相关光谱荧光量子点蛋白质冕温度和pH依赖性