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基于多巴胺适配体标记的碳点和纳米石墨的荧光生物传感平台的构建及其应用

基于多巴胺适配体标记的碳点和纳米石墨的荧光生物传感平台的构建...

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作者：朱玲南京医科大学

学位级别：硕士

多巴胺(Dopamine, DA)作为中枢神经系统一种重要的单胺类神经递质,对心血管系统、中枢神经系统、内分泌系统等具有广泛而重要的影响。体内DA含量缺乏可能会引起多种神经系统性疾病,如阿尔茨海默症、精神分裂症、帕金森综合征等;而体内D... 详细信息

多巴胺(Dopamine, DA)作为中枢神经系统一种重要的单胺类神经递质,对心血管系统、中枢神经系统、内分泌系统等具有广泛而重要的影响。体内DA含量缺乏可能会引起多种神经系统性疾病,如阿尔茨海默症、精神分裂症、帕金森综合征等;而体内DA含量过高则会导致机体处于兴奋或焦虑状态。体内DA含量的快速、准确检测在神经系统性疾病的临床诊断以及病理机制研究方面具有十分重要的作用。但由于生物基质的构成复杂,且DA含量非常低,所以构建高灵敏度、高选择性的DA快速分析方法具有十分重要的现实意义。碳点(Carbon dots, CDs)又称荧光碳纳米颗粒,是一种以碳为骨架结构,粒径小于10 nm的类球形荧光纳米颗粒。CDs不仅具有传统半导体量子点的光学性能(如激发谱带宽、发射谱带窄、荧光强度高、光化学稳定性好等),还具有高量子产率,低细胞毒性,高生物相容性,发射谱激发波长依赖性等特性。目前以CDs为荧光探针构建的生物传感平台多基于荧光猝灭原理,但此类探针的最大缺陷在于：在较强的荧光背景下测定荧光猝灭的程度,将会极大地影响探针检测的灵敏度。因此,为了进一步提高检测的灵敏度,越来越多的研究者开始关注增强型即on-off-on型荧光CDs生物传感平台的构建。本论文以生物样品中痕量DA的检测为目的,以DA核酸适配体标记的CDs(Aptamer-CDs)作为待测物的荧光识别基团,同时以纳米石墨(***)作为荧光猝灭剂构建了能够高选择性、高灵敏度地检测生物样品中痕量DA的荧光生物传感平台,并将其成功应用于生物样品中痕量DA的检测。概要如下：1. Aptamer-CDs/NG生物传感平台的构建CDs表面的羧基经活化后与DA aptamer核酸链上修饰的氨基相作用生成酰胺键,成功合成Aptamer-CDs复合物,然后在体系中引入猝灭剂NG,Aptamer-CDs的荧光被猝灭。当体系中没有DA存在的条件下,Aptamer-CDs的荧光被猝灭;当体系中存在DA时,Aptamer-CDs可以与DA特异性结合形成特定的球状链结构,此结构从NG表面脱落,Aptamer-CDs的荧光恢复。根据Aptamer-CDs的荧光恢复程度与DA浓度之间的线性关系实现对样品中DA含量的定量检测。试验优化了Aptamer-CDs复合物合成以及传感平台应用的反应物比例、温度、时间等条件,最后通过傅立叶红外光谱,琼脂糖凝胶电泳以及高分辨透射电镜对所构建的荧光传感平台进行了结构和形貌表征,证明Aptamer-CDs/NG生物传感平台的成功构建。2. Aptamer-CDs/NG生物传感平台的应用基于Aptamer-CDs和NG,我们构建了新型的on-off-on型荧光生物传感平台,并成功实现对尿液中痕量DA含量的高灵敏度、高选择性测定。干扰试验表明,Aptamer-CDs/NG生物传感平台具有良好的选择性。研究结果表明,在最佳试验条件下,当DA浓度在0.10～5.00 nM范围内,构建的生物传感平台的荧光强度的相对变化值与DA浓度的自然对数值呈良好的线性关系,相关系数为0.9995,检测限为0.055 nM。在该方法建立的基础上,采用标准加入法,测得健康实验室志愿者的尿液(稀释60倍)中DA的含量分别为0.75 nM和0.80 nM,DA的加标回收率均在96.0%～105.2%之间,且相对标准偏差小于18.7%(n=3)。试验结果表明构建的on-off-on型荧光生物传感平台能够满足复杂生物样品中DA的分析测定要求。本论文设计的荧光生物传感平台操作绿色便捷,测定复杂生物样品时仅需进行稀释处理便可实现对样品中所含DA的快速分析测定。

关键词：碳点多巴胺适配体纳米石墨多巴胺荧光生物传感平台

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基于Poly(A)DNA模板荧光金纳米簇的化学生物传感新方法研究

基于Poly(A)DNA模板荧光金纳米簇的化学生物传感新方法研究

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作者：李阳信阳师范学院

学位级别：硕士

脱氧核糖核酸(DNA)具有序列容易设计、分子识别作用、易酶裂解和双螺旋刚性结构等诸多优点,是一种合成金属纳米簇的理想模板。作为一类新型的荧光纳米材料,金纳米簇具有合成方法简单、光学性能稳定、模板多样和不易被光漂白等优点。近年... 详细信息

脱氧核糖核酸(DNA)具有序列容易设计、分子识别作用、易酶裂解和双螺旋刚性结构等诸多优点,是一种合成金属纳米簇的理想模板。作为一类新型的荧光纳米材料,金纳米簇具有合成方法简单、光学性能稳定、模板多样和不易被光漂白等优点。近年来,金纳米簇在电分析化学、生物成像、生物传感、医疗检测等领域,引起了研究者的关注。鉴于DNA的优异特性,本文以poly(A)DNA为模板合成金纳米簇(AuNCs),并作为荧光探针构建了一系列灵敏度高、操作简单的化学生物传感新方法,用于化学、生物分子(如四环素、三聚氰胺)的检测。此外,基于富G(G-rich)DNA和DNA-AuNCs临近猝灭效应,发展了荧光生物传感新平台用于DNA的通用检测;基于DNA-AuNCs和二氧化锰(MnO)纳米片之间的相互作用,构建了一种通用的非标记型荧光生物传感平台用于DNA和蛋白质的检测。主要研究内容如下:1.以poly(A)DNA模板的AuNCs作为荧光指示剂,发展了一种快速、无标记的荧光传感方法用于四环素(TC)的检测。该方法以poly(A)DNA为模板,柠檬酸钠为还原剂,在90℃水浴条件下合成了AuNCs。该AuNCs具有荧光强度高,稳定性好的优点。在TC存在时,由于TC和AuNCs之间的相互作用,导致AuNCs荧光强度显著降低。在优化的实验条件下,该方法在室温下10 min内即可实现对TC的灵敏检测,线性范围为0.10μmol/L,检出限为20 nmol/L。此外,该方法用于牛奶样品中TC含量的检测,加标回收率为98.8%03.2%。2.利用Hg和三聚氰胺(MA)之间以及Hg和AuNCs之间结合能力的差异,以poly(A)DNA模板的AuNCs作为荧光探针,构建了一种非标记型、高灵敏的化学生物传感平台用于检测MA。在Hg存在的情况下,通过Hg和Au之间的d-d金属相互作用(5d(Hg)-5d(Au)),AuNCs的荧光被迅速猝灭。当MA引入反应体系,AuNCs的荧光恢复。这是因为Hg-MA的络合作用大于Hg-Au的相互作用,形成了更稳定的络合物,阻止了Hg猝灭AuNCs的荧光信号,导致体系荧光信号恢复。在优化的实验条件下,该方法实现了对MA的灵敏检测,线性范围为0.05μmol/L,检出限为16.6 nmol/L。此外,该方法应用于牛奶样品中MA含量的检测。3.当富含鸟嘌呤的DNA序列临近DNA-AuNCs时,通过光诱导电子转移(PET)作用,DNA-AuNCs的荧光信号显著猝灭。基于这种现象,本章构建了一种通用型荧光生物传感平台用于DNA的检测。当目标DNA(H1N1)不存在时,富含鸟嘌呤碱基的DNA(6G probe 2)和DNA-AuNCs不能杂交形成稳定的双链结构,鸟嘌呤无法足够靠近荧光基团,荧光不能淬灭。反之,当目标DNA存在时,DNA-AuNCs的杂交序列、6G probe 2的互补序列(非富含鸟嘌呤序列)分别和目标DNA杂交,形成稳定的双链结构,同时使荧光金纳米簇和富含鸟嘌呤序列相互靠近,导致AuNCs的荧光猝灭。在优化的实验条件下,该方法成功实现对H1N1的灵敏检测,线性范围为100 nmol/L,检出限为200 pmol/L。同时,该方法通过设计合适的DNA序列,可用于其他目标核酸分子的检测,具有较好的通用性。4.基于MnO纳米片和DNA-AuNCs之间的相互作用,构建了一种无标记的通用荧光生物传感平台,用于生物分子的识别。DNA-AuNCs具有良好的荧光性能,作为荧光探针。MnO纳米片具有良好的荧光猝灭性能,作为猝灭剂。MnO纳米片对DNA-AuNCs具有较高的猝灭效率,导致DNA-AuNCs的荧光显著猝灭。这主要是因为单链DNA为模板的DNA-AuNCs可以通过物理吸附作用,吸附到MnO纳米片表面,导致荧光信号降低。当目标DNA被引入该体系,DNA-AuNCs的部分序列可以和目标DNA杂交,形成稳定的双链结构,导致DNA-AuNCs和MnO纳米片表面之间的吸附作用显著减弱,DNA-AuNCs的荧光信号得以恢复。类似的,当凝血酶引入该体系,DNA-AuNCs与凝血酶可以形成DNA-凝血酶复合物,DNA-AuNCs从MnO表面解离出来,使得荧光信号恢复。该方法实现了对凝血酶的灵敏检测,线性范围为0.20 nmol/L,检出限为100 pmol/L。该方法具有简便、成本低和效率高的优点。

关键词： Poly(A)DNA模板 AuNCs 生物分子检测 MnO2纳米片荧光生物传感平台

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基于DNA-AuNCs信号增强型荧光生物传感新方法研究

基于DNA-AuNCs信号增强型荧光生物传感新方法研究

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作者：毛安丽信阳师范学院

学位级别：硕士

DNA模板的金属纳米团簇由几个到几百个金属原子组成,其尺寸介于金属原子和纳米颗粒之间,是处于原子和纳米颗粒中间的过渡形态。DNA模板的金属纳米团簇主要包括DNA模板的银纳米团簇(DNA-Ag NCs)、铜纳米团簇(DNA-Cu NCs)、金纳米团簇(DNA... 详细信息

DNA模板的金属纳米团簇由几个到几百个金属原子组成,其尺寸介于金属原子和纳米颗粒之间,是处于原子和纳米颗粒中间的过渡形态。DNA模板的金属纳米团簇主要包括DNA模板的银纳米团簇(DNA-Ag NCs)、铜纳米团簇(DNA-Cu NCs)、金纳米团簇(DNA-AuNCs)等。因其体积小、毒性小、荧光强度高、抗光漂白性能强、光学性能优异等优点,DNA-AuNCs作为一种新型的荧光纳米探针在生物传感和生物成像等领域具有较大潜在应用价值。本文以A30 DNA为模板,合成高发光强度的DNA-AuNCs,设计了基于DNA-AuNCs的无标记型多元分子逻辑门的通用平台,构建了一系列信号增强型的荧光传感平台,用于L-组氨酸、鱼精蛋白和胰蛋白酶活性的灵敏检测。主要研究内容如下:1.以DNA-AuNCs作为荧光探针,利用Hg与生物巯基/三聚氰胺作用形成更稳定的Hg(II)-巯基/Hg(II)-三聚氰胺配位复合物,以及Cu与焦磷酸盐(PPi)形成稳定的Cu(II)-PPi配位复合物,构建了非标记型多元分子逻辑门通用平台(包括NOR,XNOR,IMPLY,OR,AND,INHIBIT等逻辑门)。通过这些较强的配位作用抑制Hg/Cu介导的DNA-AuNCs荧光猝灭,导致荧光强度增强。这些分子逻辑门利用Hg、Cu、生物巯基、三聚氰胺和焦磷酸盐(PPi)作为信号输入,根据DNA-AuNCs的荧光强度来定义信号输出。通过信号输出结果,该通用平台实现了Hg、三聚氰胺、Cu和PPi的灵敏检测,其中Hg的线性范围为5～500 nmol/L检出限为3 nmol/L。三聚氰胺的线性范围为50～500 nmol/L,检出限为15 nmol/L。Cu的线性范围为0.2～5.0μmol/L,检出限为60 nmol/L。PPi的线性范围为1～7μmol/L,检出限为350 nmol/L。这些逻辑门具有成本低、操作简单、设计灵活等优点。2.利用L-组氨酸与DNA模板相互作用,DNA-AuNCs的荧光信号得到显著提高,构建了新颖的信号增强型荧光传感新策略灵敏检测L-组氨酸和咪唑基药物。在L-组氨酸存在时,DNA-AuNCs在475 nm处表现出强烈的荧光发射信号,并且其荧光量子产率(QY)由1.9%提高到6.5%。DNA-AuNCs荧光增强主要归因于L-组氨酸与DNA的相互作用,导致A30 DNA模板构象发生改变,从而提供了更好的微环境用于保护AuNCs。该方法实现了L-组氨酸的高灵敏检测,线性方程为F/F=0.0150C+1.0512(R=0.985),线性范围为1～50 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。三次重复测量的相对标准偏差(RSD)均不超过4.5%。3.基于阳离子聚电解质与DNA模板相互作用,设计了一种新型荧光传感平台灵敏检测鱼精蛋白和胰蛋白酶。当阳离子聚电解质存在时,DNA-AuNCs中带负电荷的DNA骨架与带正电荷的阳离子聚电解质发生静电吸引作用,导致DNA模板的空间构象发生变化,从而提供了更好的微环境用于稳定DNA-AuNCs。因此,AuNCs的荧光强度和稳定性同时得到提高,并且最大激发波长与发射波长几乎没有发生变化。类似的,当带正电荷的鱼精蛋白存在时,DNA-AuNCs的荧光强度增加,而胰蛋白酶能催化水解鱼精蛋白形成多肽片段,从而导致AuNCs荧光强度降低。该策略实现了鱼精蛋白与胰蛋白酶活性的灵敏检测,其中鱼精蛋白的线性方程为F/F=0.2419C+0.9784,检出限为1.7μg/mL,回收率为98.4%～101.2%。胰蛋白酶活性的线性方程为F-F=0.0152C+1.0012,线性范围为3～18 m U/mL,检出限为1m U/mL,回收率为98.6%～102.6%。

关键词：荧光生物传感平台 DNA-AuNCs 生物分子检测逻辑门 L-组氨酸检测

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