检索结果-南通市图书馆

作者：宋宁中南大学

学位级别：硕士

一、利用荧光定量实时pcr技术检测脊髓性肌萎缩症携带者与患者背景：脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是常见的新生儿致死性常染色体隐性遗传病。临床表现为脊髓前角运动神经元退行性变导致患者肢体肌肉瘫痪，重者因呼吸... 详细信息

一、利用荧光定量实时pcr技术检测脊髓性肌萎缩症携带者与患者背景：脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是常见的新生儿致死性常染色体隐性遗传病。临床表现为脊髓前角运动神经元退行性变导致患者肢体肌肉瘫痪，重者因呼吸肌瘫痪而死亡。SMN1的纯合缺失导致SMA，但同时还存在一个与SMN1高度同源的基因SMN2。SMN2与SMN1的主要差异是位于基因第7外显子内的一个同义突变(C→T)，约70％的SMN2 mRNA最终合成无功能蛋白质。由于本病目前尚无有效治疗方法，以及高达1：40的携带率，快速准确的检测SMA的携带者与患者成为降低此病发病率的关键。目前常用的基因检测方法仅可检测SMN1纯合缺失，无法检测SMA携带者。目的：建立利用荧光定量实时pcr检测SMA患者与携带者的技术平台，对本组17个SMA家系共60人，15个正常对照进行SMN1 7号外显子缺失检测。方法：以荧光定量实时pcr技术为基础，采用特异性的Taqman探针与MGB探针，选择白蛋白基因做为内参基因，优化反应条件，设计标准化检测程序，建立SMN1与ALB的反应标准曲线，根据标准曲线标准化样品的反应起始量，通过计算标准品与待测样品SMN1起始反应量之比得出样品基因组内SMN1拷贝数。结果：应用荧光定量实时pcr技术对17个SMA家系，15正常个体对照，共75人进行SMN1基因缺失检测，SMN1 7号外显子相对拷贝数分布在[0.38，0.62]，[0.78，1.2]范围内，在目前公认的单拷贝与双拷贝范围内，在17个SMA家系中，检出携带者40人，患者17人，有3人未检测出SMA 7号外显子缺失，15个正常人对照皆未检测出缺失。应用pcr-酶切法对上述样本进行检测，检出SMA患者17例，非患者43例，15例正常对照未检测到缺失，与荧光定量法结果符合。结论：①首次联合应用荧光定量实时pcr技术、MGB探针技术和ALB内对照基因，建立了在ABI Real-Time平台上诊断SMA患者、携带者的基因诊断技术平台，经实验证实，该方法快速、准确。②应用荧光定量实时pcr技术诊断了17个SMA家系共60人，检出携带者40人，患者17人，3人未检测出缺失，15例正常对照样本未见缺失。③应用pcr-酶切法检测17个SMA家系共60人，检出患者17人，15例正常对照样本未见缺失。二、基于LDAP的信息网络管理解决方案背景：目前，我国医学研究机构、大型医院已基本实现了计算机信息化管理，但在信息系统管理方面仍旧存在不少问题尚待解决。主要包括：关键业务数据量的快速增长，给原有的存储系统带来了很大压力;计算机病毒的快速传播、黑客人侵给系统管理以及数据安全带来巨大挑战;客户计算机用户权限过高，导致整个软件系统环境安全性降低、风险加剧、管理成本上升。目的：设计开发一种新型的信息网络管理整体解决方案，解决目前的系统存在的缺陷。方法：以轻量级目录访问协议(Lightweight Directory AccessProtocol，LDAP)为基础，结合Windows 2003，Windows Server UpdateService，HP Array management Utility，Firewall，Anti virus software等先进的计算机技术，解决目前系统存在的缺陷。结果与结论：新开发的系统在安全性、稳定性、移动性与兼容性方面设计了全新的架构，实现了新的功能。此系统已在医学遗传学国家重点实验室稳定运行33个月。

关键词：基因诊断荧光定量实时pcr 脊髓性肌萎缩携带者轻量级目录访问协议医院信息系统

大鼠肺缺血再灌注损伤后前炎症细胞因子IL-1β mRNA的表达分析

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复旦学报（医学版） 2008年第4期35卷 560-563,596页

作者：陈乾坤姜格宁丁嘉安谢博雄陈晓峰同济大学附属上海市肺科医院胸外科上海200433

目的通过对大鼠移植肺灌洗后、冷缺血保存和再灌注期间前炎症细胞因子IL-1β mRNA的表达进行分析,探讨IL-1β在此过程中介导的移植肺炎性损伤机制。方法本研究大鼠分6组,包括:正常肺(未灌洗)对照组、仅肺灌洗处理组、肺灌洗后冷缺血保... 详细信息

目的通过对大鼠移植肺灌洗后、冷缺血保存和再灌注期间前炎症细胞因子IL-1β mRNA的表达进行分析,探讨IL-1β在此过程中介导的移植肺炎性损伤机制。方法本研究大鼠分6组,包括:正常肺(未灌洗)对照组、仅肺灌洗处理组、肺灌洗后冷缺血保存6h、12h、24h各1组、冷缺血保存24h后左肺移植再灌注3h组。在相应各时间点采取肺组织,用荧光定量实时pcr法检测IL-1β mRNA的表达并进行髓过氧化物酶(MPO)活性测定。结果除冷缺血12h组和冷缺血24h组之间IL-1β mRNA表达相对量差别不显著外(P=0.167),其余各组之间IL-1β表达相对量差别均有显著统计学意义(P<0.05)。仅灌洗组、冷缺血组和24h冷缺血移植再灌注3h组的IL-1β mRNA表达相对量均高于正常对照组,且随处理时间的延长而表达增加。仅灌洗组、冷缺血组和24h冷缺血移植再灌注3h组的MPO活性均高于正常对照组,且随处理时间的延长而表达增加,P<0.05。各组肺组织中MPO活性和IL-1β mRNA相对表达量呈较强的正相关关系,相关系数r=0.869,P<0.01。结论前炎症因子IL-1β在肺缺血再灌注损伤机制中发挥着重要炎性损伤作用,可以作为移植肺功能评价及预后的重要指标之一;IL-1β基因的表达在保存液灌洗后的冷缺血保存早期就开始出现,而不是在再灌注之后的事件。

关键词：前炎症细胞因子 IL-1β 荧光定量实时pcr 肺缺血再灌注损伤肺移植大鼠

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布与时序性表达

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中国农业科学 2012年第19期45卷 4057-4066页

作者：杨静杨军黄继超何玮玲张驰黄明南京农业大学食品科技学院/教育部肉品加工与质量控制重点实验室南京市产品质量监督检验院

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用pcr技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标... 详细信息

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用pcr技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量pcr研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高(27.45%)。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达量以及不同菌株中同一肠毒素基因的相对表达量均差异较大。【结论】本文系统研究了肠毒素基因在食源性金黄色葡萄球菌中的分布,并探究了肠毒素基因的时序性表达规律,对金黄色葡萄球菌毒力机制研究与食品质量安全控制具有参考意义。

关键词：食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型时序性表达荧光定量实时pcr

α_1-A-肾上腺素受体在SD大鼠输尿管上的分布

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广东医学 2013年第17期34卷 2597-2599页

作者：朱建国陈卫红徐述雄王元林孙兆林何慧婵钟惟德贵州省人民医院泌尿外科贵阳550002 广东省广州市第一人民医院广东省泌尿外科重点实验室 510180

目的探讨α1-A-肾上腺素受体(α1-A-AR)在不同性别、不同月龄段SD大鼠输尿管上段、中段及下端的分布。方法取2.5、8及18月龄的雄性及雌性SD大鼠各5只,处死后分别取上段、中段及下段输尿管,免疫组化实验观察α1-A-AR在3段输尿管中的表达... 详细信息

目的探讨α1-A-肾上腺素受体(α1-A-AR)在不同性别、不同月龄段SD大鼠输尿管上段、中段及下端的分布。方法取2.5、8及18月龄的雄性及雌性SD大鼠各5只,处死后分别取上段、中段及下段输尿管,免疫组化实验观察α1-A-AR在3段输尿管中的表达情况;荧光定量实时pcr(qRT-pcr)技术测定α1-A-AR mRNA在3段输尿管中的表达水平。结果免疫组化实验显示,α1-A-AR在输尿管下段的阳性率显著高于输尿管上段及中段(P0.05);qRT-pcr结果显示,α1-A-AR在各月龄(P=0.002)和输尿管各段(P0.05);输尿管下段的α1-A-AR表达量较上段及中段显著增多(P<0.001)。结论输尿管下段结石或许可根据α1-A-AR在输尿管中的表达分布使用高选择性α1-A-AR阻滞剂治疗。

关键词： α1-A-肾上腺素受体 SD大鼠输尿管荧光定量实时pcr

中国明对虾Toll样受体基因的克隆和表达分析

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中国明对虾Toll样受体基因的克隆和表达分析

作者：杨昌健中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：硕士

对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993年对虾白斑病暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振。引起对虾大规模死亡的原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、对虾种质退化和抗病力下降。因... 详细信息

对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993年对虾白斑病暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振。引起对虾大规模死亡的原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、对虾种质退化和抗病力下降。因此,深入开展对虾免疫机制研究,并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法,改良种质和培育抗病品系,已成为对虾养殖业走可持续发展之路的当务之急。 Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族是进化保守的哺乳动物模式识别蛋白(pattern recognition receptors, PRR),在先天免疫系统中起着非常重要的作用。本研究采用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从中国明对虾中克隆到Toll样受体同源基因,并将其命名为FcToll。它全长4115 bp,3’UTR包含16个poly A尾巴,开放阅读框编码931个氨基酸的多肽。预测的该多肽包含典型的Toll样受体结构,分为胞外区、跨膜区和胞内区。其中胞外区有信号肽,有16个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats, LRR),并含有2个LRR-C末端基序和2个LRR-N末端基序;跨膜区是23个氨基酸的一次跨膜结构域;胞内区是含有139个氨基酸的TIR结构域(Toll/Interleukin-1R)。克隆发现FcToll的基因组结构包含5个外显子和4个内含子。系统发生分析揭示FcToll归属于“昆虫型”的无脊椎动物Toll样受体家族。组织分布研究发现FcToll在中国明对虾中是组成型表达的,在淋巴器官中表达量较显著。分别利用不同病原体刺激健康的中国明对虾,Real-time pcr发现该基因在刺激后表达水平呈现不同的表达谱:灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)注射后5小时,该基因表达显著上调;而WSSV(white spot syndrome virus)注射后该基因表达则迅速下调,感染后23小时内其表达水平均低于对应时间点的对照组。这就表明FcToll可能参与中国明对虾的先天免疫防御,尤其可能参与入侵弧菌的免疫应答。

关键词：中国明对虾基因克隆荧光定量实时pcr 模式识别受体 Toll样受体先天免疫鳗弧菌 WSSV

亚洲玉米螟免疫相关模式识别受体基因β-1,3-GRP的cDNA克隆及表达...

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作者：吴桃燕扬州大学

学位级别：硕士

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)幼虫体内一种与免疫相关的模式识别受体β-1,3-葡聚糖识别蛋白(ββGRPs)表达调控的分子机理,本文利用RACE技术从亚洲玉米螟幼虫体内克隆得到β-1,3-eRr,的cDNA序列,对β-1,3-GRP基因序列... 详细信息

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)幼虫体内一种与免疫相关的模式识别受体β-1,3-葡聚糖识别蛋白(ββGRPs)表达调控的分子机理,本文利用RACE技术从亚洲玉米螟幼虫体内克隆得到β-1,3-eRr,的cDNA序列,对β-1,3-GRP基因序列进行了生物信息学分析,摸索了原核表达β-1, 3-GRP蛋白的条件。对亚洲玉米螟5龄幼虫进行细菌注射,通过荧光定量实时pcr检测注射前后β-1,3-GRP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下：(1)采用RT-pcr及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆β-1,3-GRP基因全长cDNA序列。该基因全长1570 bp核苷酸(GenBank登录号：KF425324),包含一个1452 bp的开放阅读框(ORF),一个14 bp的5’非编码区(5’UTR)和一个104 bp的带有加尾信号的3’非编码区(3'UTR) 。开放阅读框从第15个核苷酸开始,终止于第1469个核苷酸,起始密码子ATG,终始密码子TGA,由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸,长为484个氨基酸。Of-β-1, 3-GRP蛋白的计算分子量约为53.37 kDa,估测等电点pI为6.46。生物信息学分析表明：β-β-1, 3-GRP蛋白无跨膜结构域,N端含有信号肽,切割位点为25与26位氨基酸之间,有2个糖基化位点,分别位于139位和141位,含有44个磷酸化位点,均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明：Of-β-1, 3-GRP的氨基酸序列与棉铃虫Helicoverpa armigera β-1,3-GRP3,家蚕Bombyx mori β-1, 3-GRP2,烟草天蛾Manduca sexta GNBP,烟草天蛾M. sexta β-1, 3-GRP3,玉带凤蝶Papilio polytes革兰氏阴性菌结合蛋白3、柑橘凤蝶Papilio xuthus革兰氏阴性菌结合蛋白3高度同源。(2)采用pET-28b原核表达系统对β-1,3-GRP蛋白进行了原核表达,结果显示,Of-βGRP重组蛋白在IPTG的梯度诱导之后在沉淀中均有大量表达,重组表达蛋白质分子的大小与预测蛋白分子量大小一致,约为53kDao。pET-28b-β-1, 3-GRP在28℃温度下,可以明显看到1.0 mmol/L 和 1.2 mmol/L IPTG诱导下碎菌上清中有明显的蛋白表达。(3)通过Real time pcr检测注射后不同时间(0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24 h, 36 h) fl-1, 3-GRP基因在亚洲玉米螟幼虫不同组织(血细胞、中肠、脂肪体、体壁)中的表达变化。结果表明：血细胞中,注射后6h,生理盐水组、枯草芽孢杆菌组和大肠杆菌组β-,,3-GRP表达水平均开始上升(p<0.05)。12h后,大肠杆菌处理组和枯草芽孢杆菌组防1,3-GRP表达水平都达到峰值,随着时间延长,表达量开始急剧下降。在中肠和脂肪体中,三个处理细β-1, 3-GRP表达平均呈先增后降的趋势,但在中肠中,大肠杆菌处理组表达水平变化趋势较枯草芽孢杆菌处理组明显,在脂肪体中二者差异不明显。在中肠组织中,β-1,3-GRP作为一种响应革兰氏阴性菌袁面p-1,3-葡聚糖的受体,对大肠杆菌的响应要较革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌快。在体壁组织中,与对照组相比,生理盐水缈1,3-GRP基因表达水平变化不大,枯草芽孢杆菌组β-1,3-GRP基因表达水平4h时达到峰值,之后缓慢下降,而大肠杆菌组β-1,3-GRP基因表达水平2h时达到峰值,之后缓慢下降。总体来说,不同组织β-1,3-GRP基因对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的反应速度以及注射后表达量的变化存在差别,但是两种细菌都能够引起β-1,3-GRP基因在转录水平上的表达量显著变化。

关键词：亚洲玉米螟 β-1,3-GRP cDNA克隆原核表达细菌注射荧光定量实时pcr

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儿童肺炎支原体肺炎并肺不张临床研究

儿童肺炎支原体肺炎并肺不张临床研究

作者：曾丽娥福建医科大学

学位级别：硕士

第一部分纤维支气管镜在儿童肺炎支原体肺炎并肺不张中的应用目的:评估经纤维支气管镜肺泡灌洗术在儿童肺炎支原体肺炎并肺不张治疗中的价值。方法:选择2015年5月至2015年11月收住我院呼吸科病房,符合肺炎支原体肺炎并肺不张诊断标准的... 详细信息

第一部分纤维支气管镜在儿童肺炎支原体肺炎并肺不张中的应用目的:评估经纤维支气管镜肺泡灌洗术在儿童肺炎支原体肺炎并肺不张治疗中的价值。方法:选择2015年5月至2015年11月收住我院呼吸科病房,符合肺炎支原体肺炎并肺不张诊断标准的患儿243例,在原有治疗的基础上,根据是否行支气管肺泡灌洗术分为纤支镜灌洗组138例和非纤支镜灌洗组105例,比较两组在体温正常时间、咳嗽消失时间、治疗后1周、2周、4周胸部X线(以下简称胸片)病灶吸收显效率、住院时间、远期并发症发病率。结果:与非纤支镜灌洗组比较,纤支镜灌洗治疗组体温正常时间、咳嗽消失时间、住院时间缩短,肺功能及HRCT异常例数减少,治疗后1周、2周胸片病灶吸收显效率显著升高,差异均有统计学意义(Ppcr法检测咽拭子、BALF中MP-DNA,入院当天及病程中动态采血,留取双份血清,以双份血清MP抗体滴度呈4倍以上增高确诊为MP感染,对不同标本及不同检测方法进行对比研究。结果:以双份血清特异性抗体呈4倍以上升高为确诊标准,首份血清MP抗体检出阳性81例(49.1%),敏感度46.6%,特异度44.7%;BALF中MP-DNA检出阳性119例(72.1%),敏感度99.2%,特异度95.7%;咽拭子MP-DNA检出阳性43(26.1%),敏感度33.1%;特异度91.5%。首份血清MP抗体阳性检出率及咽拭子MP-DNA阳性检出率均低于双份血清抗体呈4倍以上升高的阳性检出率(P=0.000,0.000),BALF中MP-DNA阳性检出率与确诊标准比较无明显差异(P=0.903)。结论:FQ-pcr检测BALF中MP-DNA具有较高的敏感度、特异度,对临床早期诊断MPP具有重要意义;而单份血清MP抗体检测及咽拭子MP-DNA检测可能会引起漏诊。

关键词：肺炎支原体肺炎肺不张纤维支气管镜支气管肺泡灌洗肺炎支原体肺炎支气管肺泡灌洗液 DNA拷贝量儿童肺炎支原体肺炎血清特异性MP抗体支气管肺泡灌洗液咽拭子荧光定量实时pcr

葡萄球菌肠毒素A真核表达质粒的构建及其在喉癌Hep-2细胞来源exosomes中的表达

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中华生物医学工程杂志 2017年第3期23卷 183-188页

作者：田涵斋吉晓滨谢景华刘启才广州市第一人民医院耳鼻喉科 510180 广州医科大学实验医学研究中心

目的构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）与糖基化磷脂酰肌醇（GPI）的真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI并转染人喉癌细胞株Hep-2细胞,检测Hep-2细胞分泌的exosomes中SEA的表达.方法利用NOT I酶切原核生物质粒pGSI-SEA-GPI粘性末端,琼脂糖... 详细信息

目的构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）与糖基化磷脂酰肌醇（GPI）的真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI并转染人喉癌细胞株Hep-2细胞,检测Hep-2细胞分泌的exosomes中SEA的表达.方法利用NOT I酶切原核生物质粒pGSI-SEA-GPI粘性末端,琼脂糖凝胶电泳分离、提纯目的基因SEA-GPI,利用T4连接酶连接真核表达质粒pmiR-RB-REPORT与SEA-GPI构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.脂质体法转染pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI至Hep-2细胞,荧光定量实时pcr（qRT-pcr）检测Hep-2细胞SEA-GPI mRNA的表达.提取Hep-2细胞分泌的exosomes,免疫印迹测定SEA在exosomes中的表达.结果琼脂糖凝胶电泳显示成功构建真核表达质粒***-pcr检测显示,pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI转染的Hep-2细胞SEA-GPI mRNA显著表达.免疫印迹显示Hep-2细胞分泌的exosomes中存在SEA蛋白表达.结论 SEA可能通过GPI结构锚定于exosomes膜上,为制备含有SEA-GPI锚定蛋白的SEA-eoxsomes瘤苗提供了依据.

关键词：葡萄球菌肠毒素A 糖基化磷脂酰肌醇转染 exosomes 荧光定量实时pcr

lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

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湖北大学学报（自然科学版） 2020年第5期42卷 471-475,483页

作者：邓明勇李画敏魏子贡湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介... 详细信息

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19~168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.

关键词：毕赤酵母多拷贝质粒整合缺陷型标记荧光定量实时pcr