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荧光共振能量转移在光学成像恢复中的应用

激光杂志 2021年第4期42卷 144-148页

作者：钟春晓王锦丽李蓉任喜梅华东交通大学理工学院南昌330100

简易光学系统通常存在严重像差,容易产生成像模糊,出现失真的问题,为解决上述问题,提出将荧光共振能量转移应用到光学成像恢复中。分析光学成像过程,获取频域降质模型,根据傅里叶变换相关理论,通过光瞳函数分别计算点扩散函数和光学传... 详细信息

简易光学系统通常存在严重像差,容易产生成像模糊,出现失真的问题,为解决上述问题,提出将荧光共振能量转移应用到光学成像恢复中。分析光学成像过程,获取频域降质模型,根据傅里叶变换相关理论,通过光瞳函数分别计算点扩散函数和光学传递函数,分析变换趋势;结合荧光共振能量转移发生条件,确定荧光强度增加量和供体通道中荧光强度减小量的比值,得到有效能量转移效率;利用改进阈值处理法,经过多层小波变换去除成像噪声;建立模糊区域表达式,获取分割阈值,完成图像分割,在平滑轮廓与角点轮廓两种情况下实现成像恢复。仿真结果表明,该方法可以提高图像信噪比,对模糊部分精准复原。

关键词：荧光共振能量转移光学系统成像恢复多层小波变换阈值分割

双通道结构光照明超分辨定量荧光共振能量转移成像系统

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物理学报 2023年第20期72卷 276-285页

作者：罗泽伟武戈陈挚邓驰楠万蓉杨涛庄正飞陈同生华南师范大学生物光子学研究院教育部激光生命科学重点实验室广州510631 华南师范大学生物光子学研究院广东省激光生命科学重点实验室广州510631

基于结构光照明(structured illumination,SI)的超分辨荧光共振能量转移(super resolution fluorescence resonance energy transfer,SR-FRET)成像技术(SISR-FRET)可以通过解析活细胞内亚衍射区域的FRET信号来研究细胞器精细结构上的分子结构与功能.SISR-FRET成像中激发发射通道切换导致成像速度较慢,限制了SISR-FRET在快速成像中的应用.针对此问题,本文提出一种双通道结构光照明超分辨定量FRET成像系统和方法,通过在成像光路中加入FRET双通道成像和配准模块,实现了SISR-FRET激发发射通道的空分切换以及通道复用.结合通道亚像素配准校正的图像重建算法,双通道SISR-FRET可以在保持定量超分辨FRET分析的同时提升了3.5倍时间分辨率.利用搭建的多色SIM系统进行了活细胞表达靶向线粒体外膜FRET标准质粒的超分辨成像实验,验证了双通道SISR-FRET的时空分辨率增强和FRET定量分析的保真度.

关键词：荧光共振能量转移结构光照明超分辨活细胞

荧光共振能量转移技术检测蛋白激酶A在MIN6细胞分泌胰岛素机制中的作用

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医学研究生学报 2021年第1期34卷 26-29页

作者：安学院丁艳洁李思源李军常子涛石河子大学医学院石河子832000 石河子大学第一附属医院内分泌代谢科石河子832000 鹤壁市人民医院病理科鹤壁458000

目的蛋白激酶A(PKA)参与小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞分泌胰岛素的机制尚不明确。文中旨在不同浓度的葡萄糖环境下,给予不同浓度的胰升血糖素和异丙肾上腺素(ISO)后MIN6细胞胰岛素和PKA水平变化,探讨PKA在MIN6细胞中分泌胰岛素的作用和机... 详细信息

目的蛋白激酶A(PKA)参与小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞分泌胰岛素的机制尚不明确。文中旨在不同浓度的葡萄糖环境下,给予不同浓度的胰升血糖素和异丙肾上腺素(ISO)后MIN6细胞胰岛素和PKA水平变化,探讨PKA在MIN6细胞中分泌胰岛素的作用和机理。方法体外培养MIN6细胞,在葡萄糖0、2.8、16.7 mmol/L时分别给予胰升血糖素0、500、1000 ng/L干预处理,用荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器技术测PKA水平,用ELISA测胰岛素水平,并在添加ISO前后,检测并比较PKA和胰岛素的变化水平。结果葡萄糖浓度2.8、16.7 mmol/L时,500 ng/L胰升血糖素(ISO+)、1000 ng/L胰升血糖素(ISO-)PKA的表达水平较500 ng/L胰升血糖素(ISO-)明显升高(P<0.05);1000 ng/L胰升血糖素(ISO+)PKA的表达水平较500 ng/L胰升血糖素(ISO+)、1000 ng/L(ISO-)明显升高(P<0.05)。0 mmol/L葡萄糖时,1000 ng/L胰升血糖素的胰岛素增量较0 ng/L胰升血糖素明显升高(P<0.05)。2.8、16.7 mmol/L葡萄糖时,500 ng/L、1000 ng/L胰升血糖素的胰岛素增量较0 ng/L胰升血糖素明显升高(P<0.05)。未添加ISO时,细胞上清液的胰岛素含量与PKA呈正相关(r=0.810,P<0.05);添加ISO后,细胞上清液cAMP与胰岛素含量亦呈正相关(r=0.791,P<0.05)。结论基于FRET的生物传感器技术可在活细胞上实时动态检测PKA的变化,胰升血糖素以浓度递增的形式通过增加MIN6细胞内PKA的浓度来促进胰岛素分泌,且这种作用具有一定的葡萄糖依赖性。

关键词：胰升血糖素 MIN6细胞蛋白激酶A 胰岛素荧光共振能量转移

荧光共振能量转移技术在检测环磷酸腺苷信号通路对于MIN6细胞胰岛素分泌机制中的作用

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中国糖尿病杂志 2018年第1期26卷 59-63页

作者：石艳秋李军李思源张震丁艳洁石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科 832000 石河子大学医学院郑州市第一人民医院神经科重症监护室

目的探讨不同浓度的胰升血糖素(Glg)在无糖、低糖、高糖的环境下通过环磷酸腺苷(cAMP)信号通路对胰岛素分泌的直接调控作用及机制,基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器技术可作为一种用来在活细胞上实时定量检测第二信使cAMP水平的... 详细信息

目的探讨不同浓度的胰升血糖素(Glg)在无糖、低糖、高糖的环境下通过环磷酸腺苷(cAMP)信号通路对胰岛素分泌的直接调控作用及机制,基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器技术可作为一种用来在活细胞上实时定量检测第二信使cAMP水平的方法。方法体外培养MIN6细胞,在葡萄糖0、2.8、16.7 mmol/L下予Glg 0、100、500、1000ng/L干预处理,ELISA检测不同处理下MIN6胞内cAMP量和胰岛素释放量;电转染法将质粒ICUE3转染进入MIN6细胞,用FRET技术检测细胞内cAMP水平。结果 ELISA与FRET技术检测的cAMP含量结果基本相同,印证了FRET检测cAMP的可行性;无糖、低糖及高糖环境下,cAMP含量及胰岛素的分泌量为1000ng/L组高于500、100、0ng/L组,500ng/L组高于100ng/L和0ng/L组;在低糖及高糖环境下,100ng/L组高于0ng/L组(P<0.05),且葡萄糖浓度越高趋势越明显。Pearson相关性分析结果显示,MIN6细胞内cAMP含量与胰岛素分泌量呈正相关(R2=0.559,P<0.01)。结论基于FRET的生物传感器技术可以作为一种用来在活细胞上实时定量检测第二信使cAMP水平的方法。Glg可能以浓度梯度的形式通过上调胰岛β细胞胞内cAMP浓度来促进Ins分泌,有一定的葡萄糖依赖性。

关键词：胰升血糖素胰岛素 MIN6细胞环磷酸腺苷荧光共振能量转移酶联免疫吸附法

荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

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光谱学与光谱分析 2021年第4期41卷 1023-1031页

作者：罗淋淋牛敬敬莫蓓莘林丹樱刘琳深圳大学生命与海洋科学学院广东省植物表观遗传学重点实验室广东深圳518060 深圳大学龙华生物产业创新研究院广东深圳518060 深圳大学物理与光电工程学院广东深圳518060

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。光学技术的快速... 详细信息

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势,如:实现对活细胞的实时“可视化”研究,同时具有高时空分辨率;检测更加灵敏、结果可信度高;且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。介绍FRET-FLIM技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了FRET-FLIM技术的未来发展趋势,以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解。

关键词：荧光共振能量转移荧光寿命显微成像蛋白相互作用疾病诊断

基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器检测环丙沙星

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分析试验室 2023年第11期42卷 1483-1488页

作者：李滨汐王婷王安琪王雪钱美汝朱咏莉李胎花南京林业大学生物与环境学院南方现代林业协同创新中心南京210037 江苏洪泽湖湿地生态系统国家定位观测研究站洪泽223100

建立了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星(CIP)。为了防止羧基荧光素(FAM)被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明(TAMRA)分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体(TAMRA-APT),通过DNA杂... 详细信息

建立了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星(CIP)。为了防止羧基荧光素(FAM)被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明(TAMRA)分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体(TAMRA-APT),通过DNA杂交发生FRET,TAMRA有效猝灭FAM的荧光。CIP加入后,其与FAM-cDNA发生亲和力竞争反应,CIP与TAMRA-APT形成结构更稳定的CIP/TAMRA-APT复合物,使体系FAM的荧光恢复。在优化条件下,本方法对CIP表现出高灵敏度和高选择性,检测浓度线性范围为0.01~1μmol/L,检出限为6 nmol/L;对实际水样和牛奶的加标回收率为90.4%~113.2%,相对标准偏差为1.8%~11%。该荧光适配体传感器具有成本低、灵敏度高、特异性好等优点,在环境中CIP残留快速检测方面具有良好的应用潜力。

关键词：适配体传感器环丙沙星氟喹诺酮类抗生素荧光共振能量转移荧光猝灭

荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证

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安徽医科大学学报 2018年第12期53卷 1821-1827页

作者：钱月娇冯钰斌钱学文朱传君李鸽卢多陈飞虎安徽医科大学药学院合肥230032 中国医学科学院药物研究所北京协和医学院北京100032

目的构建携带FRET体系(YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌(E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性。方法分别构建N端、C端以及两端分别编码YFP和(或) CFP的6个原核表达工程质粒:pN... 详细信息

目的构建携带FRET体系(YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌(E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性。方法分别构建N端、C端以及两端分别编码YFP和(或) CFP的6个原核表达工程质粒:pNYFP、pCYFP、pNCFP、pCCFP、pYFP-CFP、pCFP-YFP。设计YFP-CFP和CFP-YFP作为阳性对照,而等量的YFP与CFP混合的体系(YFP+CFP)作为阴性对照。将过表达的工程蛋白通过镍柱、分子筛层析柱进行初步纯化后使用酶标仪检测相同摩尔浓度纯化蛋白的FRET信号。在此基础上,进一步用酶标仪检测表达工程蛋白的菌液中的FRET信号。结果通过测序验证,成功构建了6个原核表达的工程质粒。酶标仪检测的结果显示在体外纯化蛋白条件和菌液条件下均可产生明确的FRET信号。结论成功构建了FRET体系的原核表达工程质粒,不仅验证了蛋白条件下的可行性,而且验证了菌液条件下的可行性,为在活细胞条件下对蛋白-蛋白相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的实验方法。

关键词：荧光共振能量转移蛋白-蛋白相互作用活细胞原核表达工程质粒蛋白纯化

基于上转换纳米粒子-金纳米棒的荧光共振能量转移免疫分析法用于癌胚抗原检测

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分析化学 2022年第9期50卷 1299-1307页

作者：于绍楠任玲玲任立群白应洁刘桂锋张婳王振新吉林大学中日联谊医院放射线科吉林大学药学院中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室

构建了一种基于上转换纳米粒子(Upconversion nanoparticles, UCNP)-金纳米棒(Gold nanorods, GNR)的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)免疫分析方法用于灵敏检测癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)。以UCNP作为供体，GNR作为受体，将CEA抗体通过共价偶联的方式分别修饰在UCNP和GNR表面，形成抗体偶联物UCNP-cAb和GNR-dAb,当引入CEA后，通过抗原-抗体相互作用形成“三明治”夹心复合物，导致UCNP与GNR相互靠近发生FRET,并且荧光淬灭效率与CEA浓度呈正相关。基于此建立了检测CEA的FRET免疫分析方法，线性范围为0.01～100 ng/mL,检出限(S/N=3)为0.01 ng/mL。采用构建的FRET免疫分析方法实现了对缓冲溶液和人血清样本中的CEA的检测。本方法具有良好的选择性，有望用于临床检测，为相关癌症的早期诊断、治疗及预后监测等提供了新方法。

关键词：上转换纳米粒子金纳米棒荧光共振能量转移癌胚抗原定量检测

荧光共振能量转移核酸探针的构建及其在疾病标志物检测中的应用研究

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荧光共振能量转移核酸探针的构建及其在疾病标志物检测中的应用研...

作者：曾平西南大学

学位级别：硕士

随着科学技术的发展,荧光共振能量转移技术在生化分析和临床诊断中有着越来越广泛的应用。基于能量转移技术的核酸探针以核苷酸序列作为基本骨架,以碱基互补配对或其他相互作用方式作为识别机制,根据供体和受体间能量转移成功实现与否... 详细信息

随着科学技术的发展,荧光共振能量转移技术在生化分析和临床诊断中有着越来越广泛的应用。基于能量转移技术的核酸探针以核苷酸序列作为基本骨架,以碱基互补配对或其他相互作用方式作为识别机制,根据供体和受体间能量转移成功实现与否产生光信号或者电信号变化,将探针和靶物之间的作用体现出来。目前基于能量转移的核酸探针已经成功应用于检测生物小分子、蛋白质、核酸以及多种疾病标志物。然而,传统的能量转移荧光探针多采用单供体-单受体能量转移对。在仅有单个供体存在能量转移体系中,受能量转移效率的限制,供体荧光不能被完全猝灭,整个探针体系存在较高的背景信号和较低的信噪比,从而影响检测的灵敏度和准确性。为了解决这个问题,本论文通过构建单供体-多受体能量转移体系,结合核酸三螺旋结构,双核酸催化组装(catalyzed hairpin assembly,CHA)信号放大技术等构建了一系列通用型的低背景信号能量转移探针,实现了DNA,microRNA的灵敏检测,并将其进一步拓展应用到癌症的早期诊断中。本论文主要展开了以下两个工作:(1)设计了一种基于能量转移的单供体-四受体三螺旋核酸探针,并成功实现了丙型肝炎病毒DNA的灵敏检测。本设计以核苷酸序列为基本骨架,在核酸序列两端修饰相应的供体和受体,并在合适条件下孵育,核酸序列间通过Waston-Crick氢键碱基配对和Hoogsteen氢键互补配对形成单供体-四受体的三螺旋核酸探针。当靶物不存在的时候,形成的三螺旋结构拉近供受体间的距离,能量转移发生,供体荧光猝灭。靶物存在时,其和探针的识别序列结合,促使三螺旋结构解体,标记在核酸序列上的供受体距离也随之增大,能量转移过程受阻,供体的荧光得以恢复。该方法通过增加供体的数量而显著提高了供受体间的能量转移效率,极大地降低了荧光探针在检测过程中的背景信号,提高了检测体系的灵敏度和选择性。(2)设计了一个无酶信号放大的单供体-多受体能量转移核酸探针用于microRNA-21的灵敏检测。该方案进一步引入双核酸催化组装(catalyzed hairpin assembly,CHA)信号放大技术,显著放大了探针在检测时产生的响应信号,极大降低了反应的检测限,提高了检测的灵敏度,并成功将该方法运用于microRNA-21的灵敏检测。该方法以核酸序列作为靶物的识别单元,与传统的microRNA-21检测方法相比,具有快捷、操作简单、经济实惠、检测限低等优点。同时,通过引入CHA技术进行反应信号循环放大,进一步提高了检测的灵敏度。在此设计中,标记有能量受体染料且含有microRNA-21识别序列的核苷酸链通过和标记有供体染料的另一段核苷酸序列互补配对,形成一个单供体-二受体的能量转移探针。由于供受体间能量转移的存在,探针表现出受体的荧光信号。当加入microRNA-21时,其与探针的识别序列结合,使得三螺旋结构解体,供受体间的能量转移受阻,供体的荧光恢复。同时,靶物和探针形成的双螺旋结构又能和发卡结构H1反应,置换出microRNA-21,与其他三螺旋探针反应,从而实现CHA循环,实现信号放大。即便加入少量的microRNA-21也可以通过此循环和大量的核酸探针进行反应,产生明显的荧光信号,从而实现microRNA-21的灵敏检测。此外,这还是一个通用型的检测方法,通过改变识别序列的种类便可实现不同靶物的灵敏检测。综上所述,在本研究中,我们设计了低背景信号、高选择性的单供体-多受体能量转移探针检测方法,该方法已经成功应用到疾病标志物(丙型肝炎病毒DNA,microRNA-21)的分析检测中。同时,通过结合信号放大方法,进一步提高了能量转移探针检测方法的灵敏度和选择性,为疾病的早期诊断和治疗提供了简洁迅速的方法。此外,这些方法还具有通用性,只要更换不同的核酸识别序列,便可进行其他靶物的分析检测。

关键词：荧光共振能量转移核酸探针三螺旋结构丙型肝炎病毒 microRNA-21