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安徽农业大学学报 2020年第2期47卷 173-178页

作者：韩雨希房慧郭佳静李槿年安徽农业大学动物科技学院合肥230036

为了制备草鱼重组tab1蛋白(rCitab1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci tab1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci tab1与重组表达质粒pET-32a-Ci tab1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L-^1 IPTG,37℃诱... 详细信息

为了制备草鱼重组tab1蛋白(rCitab1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci tab1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci tab1与重组表达质粒pET-32a-Ci tab1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L-^1 IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组Citab1蛋白(rCitab1)。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL-^1的r Ci tab1。最后,将rCitab1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗Citab1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci tab1蛋白。研究结果为后续深入研究Citab1蛋白功能提供了物质基础。

关键词：草鱼tab1蛋白克隆表达梯度洗涤尿素变性法抗体制备

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草鱼p38α与tab1的互作鉴定及其对抗拟态弧菌的AMPs基因转录影响

草鱼p38α与TAB1的互作鉴定及其对抗拟态弧菌的AMPs基因转录影响

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作者：韩雨希安徽农业大学

学位级别：硕士

p38α是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)家族重要成员。tab1为转化生长因子-β激活激酶1(TGF-beta-activated kinase 1,TAK1)的结合蛋白1(TAK1 binding protein 1)。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体经诱导产生的具有广谱高效抗菌活性和免疫调节作用的一类小分子多肽。在哺乳动物中已探明tab1与p38α蛋白的相互作用能够活化p38α蛋白进而通过调控AMPs表达参与宿主抗菌免疫过程。与哺乳动物相比,鱼类p38α蛋白的研究进展较为缓慢。尽管目前已陆续从多种鱼体内检测或克隆到p38α与tab1基因,但是,鱼类tab1与p38α蛋白能否互作以及两者互作是否可促进AMPs基因的转录表达仍不清楚。对此,本论文以草鱼p38α和tab1蛋白(Cip38α,Citab1)为研究对象,检测拟态弧菌感染后Cip38α和Citab1基因的转录水平,分析AMPs对拟态弧菌生长的抑制作用,探究Cip38α与Citab1蛋白是否存在互作关系,以及二者互作是否影响抗拟态弧菌AMPs基因的转录,以期从蛋白互作调控AMPs表达角度为防治鱼类弧菌病提供新策略。完成的主要研究内容与结果如下:1、拟态弧菌感染前后草鱼p38α和tab1基因的转录水平检测论文中用浓度为1×10CFU/mL的拟态弧菌人工感染草鱼,分别于感染前后不同时间采集肝、脾、头肾、肠和鳃组织,利用RT-qPCR检测感染前后Cip38α和Citab1基因在组织中的转录水平。结果显示,与感染前相比,Cip38α基因在各检测组织中的转录模式有所不同,感染后各检测时间点的脾与肝组织、24和48 h的头肾组织、24 h的鳃组织以及72 h的肠组织中该基因的转录水平均极显著上调(ptab1基因转录水平于感染后24 h在各检测组织中均呈现极显著上调(ptab1蛋白均响应抗拟态弧菌感染过程。2、Cip38α与Citab1的互作鉴定论文中用构建的重组真核表达质粒pCMV-Myc-Cip38α和pEGFP-C1-Cip38α共转HEK293T细胞,并做共转空载体对照。然后,将转染细胞的裂解液与Anti-Myc免疫磁珠进行免疫共沉淀,进而使用鼠源Anti-GFP和Anti-Myc单克隆抗体进行免疫印迹分析。最后,分别用pEGFP-C1-Cip38α单转或与pm Cherry-C1-Citab1共转CIK和HEK293T细胞,细胞经多聚甲醛固定和DAPI染核后,在荧光显微镜下观察融合蛋白的亚细胞定位。结果显示,共转目的蛋白的细胞裂解液经Co-IP后Myc-Cip38α被拉下来,用Anti-EGFP或Anti-Myc单抗可检测到EGFP-Citab1或Myc-Cip38α。与软件预测结果一样,Cip38α在胞质和胞核中均匀分布,且与Citab1蛋白存在共定位。结果表明,Cip38α和Citab1蛋白在细胞内存在互作关系。3、两种草鱼抗菌肽对拟态弧菌生长抑制作用的检测论文中首先构建两种草鱼抗菌肽基因Cihepcidin和Ciβ-defensin-1的重组真核表达质粒,并分别转染EPC(Epithelima popuasum cuprini)细胞,同时设置空质粒和细胞对照组。然后,在转染后48 h,向转染细胞中加100μL浓度为1×10 CFU/mL的拟态弧菌悬液,30℃共孵育0、4、8和12 h后采用BHI平板涂布法检测细胞培养液中的活菌数量。结果显示,Cihepcidin转染组拟态弧菌活菌数在各检测时间点均极显著低于两个对照组(p0.05)。结果表明,抗菌肽CiHepcidin与Ciβ-defensin-1均对拟态弧菌的生长具有抑制作用。4、Cip38α和Citab1互作对两种抗菌肽基因转录的影响论文中将pCMV-Myc-Cip38α与pCMV-Myc-Citab1分别单或共转CIK细胞,利用RT-qPCR检测Cip38α-Citab1互作对上述两种抗菌肽基因转录的影响。结果显示在转染后24 h,pCMV-Myc-Cip38α单转组的Cihepcidin转录水平与空载体对照组无显著变化(p>0.05)、Ciβ-defensin-1转录水平显著下调(ptab1单转组Ciβ-defensin-1转录水平与空载体对照组无显著变化(p>0.05)、Cihe

关键词：草鱼p38α蛋白草鱼tab1蛋白蛋白质互作拟态弧菌铁调素 β-防御素1

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草鱼免疫相关因子tab1的转录表达模式及其与TAK1的互作验证

草鱼免疫相关因子TAB1的转录表达模式及其与TAK1的互作验证

引用

作者：刘心媛安徽农业大学

学位级别：硕士

蛋白质之间的相互作用（简称蛋白互作）是指两种或两种以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白互作构成了细胞生化反应网络的重要组成部分。因此,研究蛋白质之间的相互作用不仅可从分子水平揭示蛋白的结构与功能,而... 详细信息

蛋白质之间的相互作用（简称蛋白互作）是指两种或两种以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白互作构成了细胞生化反应网络的重要组成部分。因此,研究蛋白质之间的相互作用不仅可从分子水平揭示蛋白的结构与功能,而且为病原微生物的致病机理及动物疫病防控的研究提供新途径。转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。TAK1结合蛋白（TAK1-binding protein 1,tab1）是一种广泛存在于无脊椎和脊椎动物细胞中的高度保守的免疫相关蛋白。目前已探明哺乳动物的tab1通过与TAK1的互作参与调控多个细胞信号转导通路,在细胞分化、细胞凋亡和天然免疫应答中发挥重要作用。与哺乳动物相比,鱼类tab1与TAK1蛋白互作研究起步较晚,仅见有大黄鱼tab1与TAK1互作研究的文献报道。我们前期研究发现,拟态弧菌靶向核酸疫苗可显著增强草鱼肠黏膜免疫,免疫肠组织中Citab1基因显著上调并富集于多个天然免疫信号通路,但Citab1与CiTAK1之间是否存在互作关系尚不清楚。对此,本课题以Citab1为研究对象,分析Citab1基因在健康草鱼组织及免疫刺激前后细胞中的转录表达模式,确定Citab1蛋白的亚细胞定位及其与CiTAK1共定位情况。在此基础上,联合利用免疫共沉淀技术和Pull-down试验验证Citab1与CiTAK1是否存在互作关系。主要研究内容与结果总结如下:1)Citab1基因的转录表达模式分析:论文中用TRNzol-A+总RNA提取试剂提取健康草鱼组织总RNA、反转录为cDNA,并以此为模板采用RT-qPCR检测Citab1基因在9种不同组织中的转录表达谱,结果发现该基因在各检测组织中广泛转录表达。随后,分别用脂多糖、肿瘤坏死因子-α和拟态弧菌疫苗抗原三种不同免疫刺激剂以不同浓度刺激草鱼肾细胞（CIK细胞）,采用RT-qPCR检测刺激前后不同时间Citab1基因的时序转录表达水平。结果表明,Citab1是一种免疫相关蛋白,三种免疫刺激剂均能刺激其转录表达水平显著上调,但时序变化水平依刺激物及其浓度的不同而异。2)Citab1蛋白亚细胞定位及其与CiTAK1共定位确定:论文中首先利用在线分析软件预测Citab1蛋白的亚细胞定位。然后,构建带有红色荧光标签的真核重组质粒pmCherry-C1-Citab1。最后,将pmCherry-C1-Citab1单转CIK与HEK293T细胞或与p EGFP-C1-CiTAK1共转HEK293T细胞,并经多聚甲醛固定细胞和DAPI染核后,在荧光显微镜下（400×）下观察荧光蛋白表达情况。结果显示,（1）预测到Citab1蛋白可能分布在细胞核中;（2）转染重组质粒pmCherry-C1-Citab1的CIK和HEK293T细胞的胞质与核胞核部位均发出红色荧光;（3）共转染pmCherry-C1-Citab1和p EGFP-C1-CiTAK1的HEK293T细胞中绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白重叠,在胞质中形成黄色荧光。结果表明Citab1蛋白分布在胞质与胞核中,并与CiTAK1在胞质中存在共定位。3)Citab1与CiTAK1的互作验证:论文中将pmCherry-C1-Citab1与pCMV-myc-CiTAK1或标签蛋白（pCMV-Myc,pmCherry-C1）共转染HEK293T细胞,以转染细胞裂解液与anti-Myc免疫磁珠进行免疫共沉淀,并通过免疫印迹检测蛋白间是否存在互作。结果显示anti-Myc单抗能从转染pmCherry-C1-Citab1与pCMV-Myc-CiTAK1以及pCMV-Myc-CiTAK1与pmCherry-C1的IP裂解液中检测到Myc-CiTAK1;anti-m Cherry单抗能从转染pmCherry-C1-Citab1与pCMV-Myc-CiTAK1的IP裂解液中检测到Cherry-C1-Citab1。结果表明CiT AB1与CiTAK1在细胞内存在互作关系。为了进一步验证上述两种蛋白是否能在体外直接结合,以纯化的His-Citab1融合蛋白为诱饵蛋白,CiTAK1为猎物蛋白进行His pull-down和免疫印迹检测。结果发现anti-His单抗可从转染细胞裂解液与重组蛋白或标签蛋白的混合物中检测到融合蛋白His-Citab1及His标签蛋白;anti-Myc单抗能从转染pCMV-Myc-CiTAK1的细胞裂解液与融合蛋白的混合物中检测到Myc-CiTAK1,但在与标签蛋白的混合物中未能检测到该蛋白。结果表明Citab1能与CiTAK1在体外直接结合。综上所述,Citab1基因在草鱼组织中广泛转录表达,免疫刺激剂可显著提高其

关键词：草鱼转化生长因子-β激活激酶1 草鱼tab1蛋白转录表达模式亚细胞定位免疫共沉淀 Pull-down

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