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调控草酸青霉产三峡肽素的候选转录因子

菌物学报 2024年第6期43卷 73-85页

作者：白晓轩李婧朱高洁刘思雨张极峰刘超刘士平三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443002

草酸青霉Penicillium oxalicum是一种重要的生防菌,本课题组前期从柑橘园附近的一株草酸青霉的发酵产物中得到一种对柑橘主要致腐菌指状青霉***具有强烈抑制作用的新型线性五肽—三峡肽素。为了解析三峡肽素的分子调控机制,提高三峡肽... 详细信息

草酸青霉Penicillium oxalicum是一种重要的生防菌,本课题组前期从柑橘园附近的一株草酸青霉的发酵产物中得到一种对柑橘主要致腐菌指状青霉***具有强烈抑制作用的新型线性五肽—三峡肽素。为了解析三峡肽素的分子调控机制,提高三峡肽素的产量,本研究对课题组前期测定的不同草酸青霉菌株和不同培养条件下的两次转录组数据库进行系统分析。通过建立各比较组间的差异基因集合并取各集合的交集,从478个转录因子中筛选到9个调控强度与草酸青霉的三峡肽素生产水平高度相关的候选转录因子,其中3个与三峡肽素生产负相关,6个与三峡肽素生产正相关,对候选转录因子及其编码基因进行了生物信息学分析,并通过qRT-PCR验证了转录组数据的准确性。本研究为解析三峡肽素分子调控机制奠定理论基础,促进了以三峡肽素为主要成分的果蔬保鲜剂开发,同时也为通过转录组数据挖掘目的基因提供了参考。

关键词：转录因子三峡肽素草酸青霉转录组次级代谢分子调控

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储藏小麦中草酸青霉的分离鉴定及其侵染防控

粮食与油脂 2024年第4期37卷 49-53,79页

作者：张双双陈亮许茜茜孙云祥薛战英河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

采用梯度稀释法从不同来源小麦中分离青霉菌株;采用经典形态学分类鉴定方法和ITS序列比对鉴定青霉菌株种属;采用琼脂稀释平板法测定香茅醇对青霉菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC);采用熏蒸法考察香茅醇对青霉侵染小麦的防控... 详细信息

采用梯度稀释法从不同来源小麦中分离青霉菌株;采用经典形态学分类鉴定方法和ITS序列比对鉴定青霉菌株种属;采用琼脂稀释平板法测定香茅醇对青霉菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC);采用熏蒸法考察香茅醇对青霉侵染小麦的防控效果。结果发现:草酸青霉是储藏小麦中的优势青霉;香茅醇对草酸青霉菌丝生长的MIC、MFC均为0.1250μL/mL;当香茅醇含量为0.250μL/mL时,草酸青霉侵染的小麦储藏5 d均未发生霉变,表明香茅醇对青霉侵染小麦具有良好的防控效果。

关键词：小麦粮食储藏草酸青霉分离鉴定

产三峡肽素的草酸青霉SG-4的全基因组测序

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生物学杂志 2024年

作者：张极峰白晓轩刘超李婧李奥刘士平三峡大学生物与制药学院

为充分解析草酸青霉SG-4的遗传信息,利用二代Illumina测序和三代PacBio测序相结合的方法对SG-4的全基因组进行测序,经过基因组组装、基因预测和功能注释后,对全基因组进行共线性分析和次级代谢产物合成基因簇预测。结果表明,草酸青霉SG-... 详细信息

为充分解析草酸青霉SG-4的遗传信息,利用二代Illumina测序和三代PacBio测序相结合的方法对SG-4的全基因组进行测序,经过基因组组装、基因预测和功能注释后,对全基因组进行共线性分析和次级代谢产物合成基因簇预测。结果表明,草酸青霉SG-4基因组全长为31.17 Mb,GC含量为50.5%,包括线粒体基因组在内,共由9条Scaffold组成,含有8 430个蛋白质编码基因、175个tRNA和50个rRNA基因。与swiss-prot、Pfam、NR、GO和KEGG等数据库相比,COG数据库注释的基因数最多,可达7483个。共线性分析结果表明,SG-4与数据库中报道的其他草酸青霉的同源性有一定差异,且存在多处异位重排现象。通过生物信息学分析发现,SG-4基因组中有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中,14个基因簇的功能未见报道,将NRPS相关基因簇与转录组数据进行对应的同时,分析与三峡肽素合成趋势的相关性,得到9条基因簇,经前期实验验证其中有一条可能是负责三峡肽素合成的候选基因簇。研究丰富了草酸青霉的基因组信息,为全面了解草酸青霉的基因组信息、揭示三峡肽素的生物合成途径奠定基础。

关键词：草酸青霉 SG-4 基因组基因注释三峡肽素

周期性施加草酸青霉与磷矿粉复配对土壤铅污染修复的影响

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湘潭大学学报(自然科学版) 2024年

作者：郭之秀李启武田江湘潭大学环境与资源学院湖南省长沙生态环境监测中心

本研究通过设置草酸青霉和磷矿粉复配的3个不同施加周期：仅施加1次（In-0）、每10 d施加（In-10）、每20 d施加（In-20），探究周期性施加对土壤重金属铅修复效果及土壤部分理化性质和酶活性的影响。结果表明，周期性施加显著降低了土... 详细信息

本研究通过设置草酸青霉和磷矿粉复配的3个不同施加周期：仅施加1次（In-0）、每10 d施加（In-10）、每20 d施加（In-20），探究周期性施加对土壤重金属铅修复效果及土壤部分理化性质和酶活性的影响。结果表明，周期性施加显著降低了土壤有效态铅含量，提高了铅的固化效率，其中In-10处理组效果最好，相比空白组降低了19.5%，促进了有效态铅向残渣态铅转变。此外周期性施加显著提高了土壤pH和有效磷含量，其中In-10处理组对土壤pH提升最为显著，In-20处理组对土壤有效磷含量提高最显著，相比空白组提高了19 mg/kg。但周期性施加对土壤阳离子浓度、酸性磷酸酶、脲酶活性的影响不显著。本研究为解磷菌与难溶性磷酸盐复配修复土壤重金属提供了改良方法。

关键词：土壤铅污染草酸青霉磷矿粉周期性修复

草酸青霉协同脱硫石膏对赤泥中团聚体分布及其稳定性的影响

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中国有色金属学报 2023年第11期33卷 3900-3913页

作者：薛生国秦信凤刘星杨兴旺邓丹丹朱锋中南大学冶金与环境学院长沙410083 中南大学国家重金属污染防治工程技术研究中心长沙410083

本文以河南某氧化铝企业赤泥为研究对象,选择脱硫石膏和草酸青霉(菌液/菌粉)作为改良剂对赤泥开展土培实验。结果表明:联合施用脱硫石膏−草酸青霉显著提高赤泥中粒径>0.25 mm水稳性团聚体的含量,以相同剂量的菌液或菌粉方式添加草酸青霉... 详细信息

本文以河南某氧化铝企业赤泥为研究对象,选择脱硫石膏和草酸青霉(菌液/菌粉)作为改良剂对赤泥开展土培实验。结果表明:联合施用脱硫石膏−草酸青霉显著提高赤泥中粒径>0.25 mm水稳性团聚体的含量,以相同剂量的菌液或菌粉方式添加草酸青霉后,粒径>0.25 mm水稳性团聚体含量分别提高48.26%和55.52%,平均质量直径(D_(mm))提高了230.4%和265.2%;采用脱硫石膏可促进粒径20~50μm微团聚体絮凝,采用草酸青霉有利于粒径>50μm团聚体的形成。180 min水力循环作用下,菌液处理后团聚体抗侵蚀能力较菌粉处理更好;草酸青霉的联合施用可将脱硫石膏用量从4%(质量分数)降至2%。相关性分析可知,pH、电导率(σ)、可交换钠离子比(γ)对赤泥团聚体稳定性影响比较显著。

关键词：赤泥草酸青霉团聚体稳定性赤泥成土过程生态修复

草酸青霉纤维素酶水解溶解浆制备纳米纤维素的研究

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草酸青霉纤维素酶水解溶解浆制备纳米纤维素的研究

作者：徐诺山东大学

学位级别：硕士

以储量丰富、可再生的天然木质纤维素为底物制备纳米纤维素(Cellulose nanocrystal,CNC)是实现木质纤维素高值化利用的有效途径。纳米纤维素的制备方法包括:化学法、物理机械法和生物法,其中生物法具有反应条件温和、环保等优点,具有更... 详细信息

以储量丰富、可再生的天然木质纤维素为底物制备纳米纤维素(Cellulose nanocrystal,CNC)是实现木质纤维素高值化利用的有效途径。纳米纤维素的制备方法包括:化学法、物理机械法和生物法,其中生物法具有反应条件温和、环保等优点,具有更好的市场应用前景。丝状真菌草酸青霉是降解木质纤维素的优良菌株,通过其分泌的纤维素酶在高固形物浓度下降解木质纤维素制备CNC,可降低生产成本,促进酶法CNC的工业化生产。然而,目前对于生物酶法在高固形物浓度下制备CNC的研究却鲜有报道。基于以上背景,本论文开展了在高固形物浓度下酶解制备CNC的研究,期望通过基因改造技术获得满足在高固形物浓度下酶解桉木溶解浆的草酸青霉工程菌株,并对酶解的机械辅助工艺、酶解条件、多段酶解工艺等进行了优化,以期望进一步提高CNC的制备效果,并对生产CNC中产生的水解液及酶解残渣的综合利用策略进行了探索,期望为实现桉木溶解浆底物的高效转化和综合利用提供了理论基础。主要研究结果如下:1.用于水解溶解浆制备CNC的纤维素酶高产菌株RE-6ΔC的构建及其评价通过实验证明草酸青霉RE-6生产的纤维素酶系具有在高固形物浓度条件下降解桉木溶解浆(EDP)制备CNC的能力,但在其酶系中含有较多的外切纤维素酶,不利于纳米纤维素的积累。以草酸青霉RE-6为出发菌株,通过敲除外切纤维素酶CBHI基因构建了工程菌株RE-6ΔC。对工程菌株RE-6ΔC的酶系组成分析发现,其内切纤维素酶比酶活相较于出发菌株RE-6提高了 34.1%,木聚糖酶比酶活提高了 47.4%,而外切纤维素酶比酶活下降了 48.4%,说明该菌株产纤维素酶的酶系特征更适合用于CNC的酶法生产。对工程菌株RE-6ΔC的纤维素酶在高固形物浓度下降解EDP制备CNC的产率和形貌进行表征发现,其CNC的产率相比于出发菌株RE-6增加了 69.1%,CNC为短丝状,粒径更加均一,尺寸与酸法相似。且其制备的CNC结晶度较高,热稳定较高,仍然保持Ⅰ型纤维素晶体结构。2.工程菌株RE-6ΔC产纤维素酶系水解溶解浆制备CNC的工艺优化研究为提高CNC的产率,对工程菌株RE-6ΔC生产的纤维素酶系水解EDP制备CNC的工艺条件进行了优化。结果发现,在利用纤维素酶水解前,首先对纸浆进行机械处理5 min以分散纤维,酶解后通过水洗并在2400g下经过离心分离,可以较好地分离出获得的CNC。进一步优化了酶水解条件工艺,得到最佳的酶解条件为酶蛋白添加量为46 mg/g DM,酶水解时间为50 h,固形物浓度条件为20%。在上述条件下,溶解浆经过三次酶水解后,CNC的得率达到23.9%(以初始原料计),相较于优化前CNC产率提升了 69.1%。此外,水解获得的葡萄糖得率为61.58%,固体残渣约占初始原料的16.96%。进一步实验还证明,在菌株RE-6ΔC的纤维素酶液中进一步添加草酸青霉来源的内切葡聚糖酶rPoCel7B和rPoCel5B,当rPoCel7B和rPoCe15B的添加蛋白量比例为1:1.06时,对CNC得率的影响最为显著,与添加前相比,CNC得率提高13.6%,且添加后,CNC的粒径有所减小,为后续菌株的进一步改造提供了参考。***制备过程废弃物酶解液和固体残渣综合利用探讨对CNC制备过程中,酶解产生的水解液的糖组分进行分析,发现其含有高浓度的葡萄糖和部分寡糖。利用商品纤维素酶SCB18对其进行水解,水解液中葡萄糖浓度可达56.6 g/L,该糖液可进一步发酵生产燃料乙醇,转化效率达到76.1%。对酶解后剩余的固体残渣的成分分析发现,其纤维素含量达到99.24%,碳水化合物含量(以纤维素计)为101.2 w/%,碳水化合物含量符合食品添加剂微晶纤维素的国家标准(GB 1886.103-2015),该固体残渣的聚合度为121,符合微晶纤维素《中国药典》质量标准(2020年版),因此,该酶解残渣有望进一步应用于食品及药品工业。利用该酶解残渣代替商品MCC添加到丝状真菌液体发酵培养基中生产纤维素酶时,发现其可以替代商品MCC作为固体碳源诱导纤维素酶的生产。对该酶解残渣的性质进行表征,结果表明,与商品MCC相比,该酶解残渣具有较低的结晶度、较小的尺寸、均一的形态结构,及较好的热稳定性,有利于其在基质材料添加和复合膜中的应用。通过上述的高产菌株的构建、酶解工艺优化以及水解液和固体残渣的综合利用处理,可望得到在高固形物浓度下的纳米纤维素的酶解制备工艺并实现酶解液和固体残渣的全组分利用。

关键词：草酸青霉纳米纤维素纤维素酶酶水解工艺优化综合利用

草酸青霉HAP复合物与染色质重塑复合物调控纤维素酶基因表达的机制研究

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草酸青霉HAP复合物与染色质重塑复合物调控纤维素酶基因表达的机...

作者：李梦雪山东大学

学位级别：硕士

木质纤维素是地球上最为丰富的生物质资源。利用纤维素酶将木质纤维素高效降解成为可发酵性糖,并将其转化为各类化学品或燃料,对于缓解人类社会面临的资源、环境等问题具有重要意义。以里氏木霉(Trichoderma reesei)、草酸青霉(Penicill... 详细信息

木质纤维素是地球上最为丰富的生物质资源。利用纤维素酶将木质纤维素高效降解成为可发酵性糖,并将其转化为各类化学品或燃料,对于缓解人类社会面临的资源、环境等问题具有重要意义。以里氏木霉(Trichoderma reesei)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等为代表的丝状真菌能够高效合成并分泌纤维素酶,是工业生产中纤维素酶的主要来源。纤维素酶的合成主要在转录水平受控。许多序列特异性的转录因子(transcription factor,TF)通过直接结合靶基因的启动子区参与纤维素酶基因转录的激活或抑制。细胞的染色质结构也会影响靶基因的表达。探索纤维素酶基因表达关键调控蛋白,特别是转录激活因子的功能,研究转录激活因子与染色质修饰复合物之间复杂相互作用的模式,可使我们更为深入地了解纤维素酶基因诱导表达的调控机制,从而为纤维素酶生产菌株的分子改造提供合理的靶点,提高菌株生产效率,具有深刻的理论意义和重要的实践意义。本文以重要的纤维素酶生产菌草酸青霉为研究对象,从转录激活因子HAP复合物的Hap5亚基的功能研究出发,探索了 HAP复合物与染色质重塑复合物RSC调控纤维素酶基因表达的分子机制。论文的研究内容及结果如下:1.草酸青霉HAP复合物调控纤维素酶基因表达的机制研究草酸青霉中Hap2、Hap3和Hap5亚基共同组成HAP复合物。研究了草酸青霉Hap5亚基(PoHap5)在草酸青霉菌丝生长、无性发育、纤维素酶基因的转录以及纤维素酶合成等生物过程中的功能。PoHap5定位于细胞核内,其缺失导致突变株(Δhap5)菌落延展变慢,分生孢子生成受损。Δhap5突变株中,位于孢子发生中心调控途径上的重要转录因子BrlA、FlbC、StuA的编码基因的转录显著下调,提示HAP复合物通过影响孢子发生中心调控途径间接调控分生孢子生成。相较出发株,Δhap5突变株的纤维素酶和胞外蛋白分泌量减少,主要外切纤维素酶基因cbh1和内切纤维素酶基因eg1的转录量显著下调,显示HAP复合物通过调控纤维素酶编码基因的表达影响纤维素酶的合成。在以PoHap5为诱饵的蛋白质串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification,TAP)和串联质谱(LC-MS/MS)(TAP-MS)的实验中,鉴定到了与已知染色质重塑复合物RSC(Remodels the Structure of Chromatin)中 10 个亚基的同源蛋白 Sth1、Rsc8、Arp9、Sfh1、Snf5、Ssr3、Arp4、Rsc1、Ssr4和Rsc7,显示HAP复合物调控基因转录的辅因子(cofactor)为染色质重塑复合物RSC。提出了 HAP复合物调控纤维素酶基因表达的可能途径:HAP复合物与纤维素酶基因启动子区上的5’-CCAAT-3’序列结合,招募染色质重塑复合物RSC作为辅因子,后者利用水解ATP的能量改变染色质结构,暴露出RNA聚合酶Ⅱ在核心启动子区上的结合位点,激活纤维素酶基因的转录。2.染色质重塑复合物RSC的Sth1亚基和FaiR亚基的功能研究确定了草酸青霉中染色质重塑复合物RSC的Sth1亚基(PoSth1)是细胞生存所必需基因,其完全缺失导致细胞死亡。在以PoSth1为诱饵蛋白进行TAP-MS的过程中,发现了一个未知功能的蛋白(PDE4776)。PDE4776为丝状真菌,特别是青霉属、曲霉属特有的蛋白。与PDE4776相互作用蛋白中,鉴定到的丰度最高的蛋白均为已经报道的染色质重塑复合物SWI/SNF或RSC的亚基的同源蛋白,包括Rsc8、Sfh1、Np16、Snf12p、Arp7、Rsc9p、Ssr4、Rsc1、Sth1、Snf21。因此,将 PDE4776 命名为 FaiR(filamentous fungi-specific accessory interactor of RSC)。草酸青霉 FaiR(PoFaiR)为组成型表达。PoFaiR的缺失突变株(ΔfaiR)在含有葡萄糖、甘露糖等不同碳源的固体平板培养基上表现生长缺陷,但在含纤维素平板上生长良好。ΔfaiR突变株的纤维素酶基因表达上调,胞外纤维素酶和总胞外蛋白分泌上升。ΔfaiR突变株对碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)不敏感,在2%微晶纤维素为碳源的摇瓶发酵中,添加葡萄糖能够促进其纤维酶基因的表达和纤维素酶合成。添加0.5%、1%、2%葡萄糖时,ΔfaiR中纤维素外切酶基因cbh1的表达量分别是出发株中的13.1、21.4、和32.8倍。葡萄糖存在下,FaiR的缺失显著上调转录激活因子ClrB和XlnR编码基因的转录

关键词： HAP复合物染色质重塑复合物草酸青霉纤维素酶碳分解代谢物阻遏

草酸青霉对赤泥成土过程团聚体稳定性调控研究

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草酸青霉对赤泥成土过程团聚体稳定性调控研究

作者：陈丽中南大学

学位级别：硕士

赤泥是氧化铝生产过程中排放的强碱性固体废弃物,综合利用难,主要以堆存方式处置。堆场生态修复是防控赤泥环境风险、实现生态化处置的适宜策略。良好团聚体结构的形成促进赤泥成土过程、实施堆场生态修复具有重要意义。草酸青霉可通过... 详细信息

赤泥是氧化铝生产过程中排放的强碱性固体废弃物,综合利用难,主要以堆存方式处置。堆场生态修复是防控赤泥环境风险、实现生态化处置的适宜策略。良好团聚体结构的形成促进赤泥成土过程、实施堆场生态修复具有重要意义。草酸青霉可通过分泌有机酸降低赤泥碱性,但是对团聚体结构形成及稳定性的影响机制尚不明晰。论文开展了草酸青霉协同多固废作用对团聚体粒径及其稳定性的影响研究,探讨不同胶结物质对赤泥团聚体形成的作用机制,提出了基于赤泥团聚体稳定性调控的微生物修复策略,为赤泥成土过程中团聚体稳定性调控提供理论依据和实践参考。(1)脱硫石膏-玉米秸秆-草酸青霉联合作用(BMG)可明显降低赤泥盐碱性,既能削减改良剂使用量,也能促进赤泥团聚体结构形成。赤泥成土过程中(60天、180天、365天),脱硫石膏-玉米秸秆-草酸青霉协同作用可显著增加水稳定大团聚体(>0.25 mm)含量,降低粉黏粒团聚体(草酸青霉施用有利于0.25-0.05 mm微团聚体的形成,而脱硫石膏则促进0.25 mm团聚体的稳定性,交换性Mg、游离态铝氧化物和有机碳则影响赤泥0.25-0.05mm团聚体的稳定性,而交换性阳离子和铁铝氧化物在草酸青霉改良赤泥可促进水稳性大团聚体形成,胞外聚合物(EPS)有利于赤泥碱性矿物絮凝和稳定。赤泥接种草酸青霉可显著增加团聚体稳定性和孔隙度(P草酸青霉处理后,赤泥细颗粒易被菌丝吸附、粘结形成更大的团聚体。胞外聚合物对赤泥碱性矿物(方钠石和钙霞石)的等温吸附符合Langmuir模型,且方钠石与胞外聚合物的吸附亲和力更强。EPS吸附后,有机矿物复合体粒径明显增大,促进赤泥微团聚体的形成与稳定。图34幅,表11个,参考文献169篇

关键词：赤泥草酸青霉团聚体形成胞外聚合物成土过程

草酸青霉翻译延伸因子eEF1A在调控生物质降解酶合成中的功能鉴定

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草酸青霉翻译延伸因子eEF1A在调控生物质降解酶合成中的功能鉴定

作者：麦容铭广西大学

学位级别：硕士

植物生物质包括纤维素、半纤维素、淀粉等,是地球上最丰富的可再生生物质资源,是生物炼制生产清洁的可再生能源的原料。植物生物质的酶解是生物炼制的关键步骤。丝状真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）能分泌完整的植物生物质降解酶... 详细信息

植物生物质包括纤维素、半纤维素、淀粉等,是地球上最丰富的可再生生物质资源,是生物炼制生产清洁的可再生能源的原料。植物生物质的酶解是生物炼制的关键步骤。丝状真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）能分泌完整的植物生物质降解酶系,但存在产酶量不足、成本高等问题,对草酸青霉植物生物质降解酶的生物合成调控机理认识有限。本实验室前期研究发现了一个负向调控草酸青霉植物生物质降解酶生物合成的新转录因子PoxCxrC,但是其分子调控机理不清楚。本研究的目的是寻找与PoxCxrC相互作用的蛋白并鉴定其在植物生物质降解酶生物合成中的功能。本研究通过串联亲和层析纯化-质谱（TAP-MS）和免疫沉淀-质谱（IP-MS）筛选得到与PoxCxrC相互作用的候选蛋白26个。进一步通过GST pulldown验证发现2个蛋白POX00101和POX06702能和PoxCxrC结合。序列分析表明POX00101与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）菌株bd-A中GTP结合蛋白Ran的一致性为94.17%;POX06702与黑曲霉（Aspergillus niger）菌株CBS 101883中延伸因子EF-1α的一致性为94.98%,说明POX00101和POX06702分别是小GTPase Ran和翻译延伸因子eEF1A。以草酸青霉突变株ΔPox Ku70为出发菌株,通过同源重组法构建了基因eEF1A的过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A。与出发菌株ΔPox Ku70相比,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A分别转接至Avicel和可溶性玉米淀粉培养基中培养2-4天,纤维素酶包括滤纸酶（Filter paper cellulase,FPase）、羧甲基纤维素酶（Carboxymethyl cellulase,CMCase）和β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-glucopyranosidase,p NPGase）产量显著提高31.03%-58.64%,木聚糖酶产量显著提高30.49%-40.61%,淀粉酶产量显著提高68.84%-100.48%,表明eEF1A过量表达能提高草酸青霉植物生物质降解酶的产量。构建草酸青霉突变体ΔPoxCxrC中过量表达eEF1A的菌株ΔPoxCxrC::eEF1A和在ΔPox Ku70中同时过量表达PoxCxrC和eEF1A的菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC::eEF1A。在Avicel、麦麸加稻杆和可溶性玉米淀粉作为碳源诱导条件下,与突变体ΔPoxCxrC相比,草酸青霉工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶产量分别提高50.40%-98.43%、45.60%-120.76%和55.4%-314.6%。以上证明,敲除PoxCxrC同时过表达eEF1A提高草酸青霉植物生物质降解酶的产量是一条可行的策略。相比之下,与ΔPox Ku70::PoxCxrC相比,双基因过表达菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC::eEF1A的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶产量无显著变化,表明提高植物生物质降解酶基因m RNA水平是提高酶产量的前提条件。蛋白质的亚细胞定位研究发现,草酸青霉过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A-gfp中重组蛋白eEF1A-GFP主要定位在细胞质及细胞核周边。双基因过表达菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC-gfp::eEF1A中重组蛋白PoxCxrC-GFP仍定位在细胞核。表型观察、孢子计数和生物量分析发现,在PDA固体培养基上,工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的菌落直径明显比突变体ΔPoxCxrC大,但与出发菌株ΔPox Ku70相比无显著差别。在PDA、Avicel、麦麸加稻杆和可溶性玉米淀粉固体培养基上,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A的孢子产量与出发菌株ΔPox Ku70相比显著增加19.3%-270.0%。在葡萄糖条件培养12 h-48 h,与出发菌株ΔPox Ku70相比,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A、突变体ΔPoxCxrC和工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的生物量无显著变化,但培养后期（60 h-72 h）生物量显著上升20.6%-30.4%。综上所述,eEF1A参与草酸青霉的生长和孢子产生。荧光定量PCR分析发现,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A和工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A中,关键植物生物质降解酶基因和孢子产生相关调控基因的表达量显著变化,其中纤维素酶和木聚糖酶基因如cbh1、eg1、Cel12A和bgl1显著上调1.0-33.0倍,淀粉酶基因Po GA15A、POX02412、amy13A及其调控基因amy R上调3.9-62.2倍;孢子产生相关调控基因如

关键词：草酸青霉 PoxCxrC eEF1A 植物生物质降解酶生物合成调控