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山核桃内生细菌ZL34的鉴定、抑菌活性及发酵培养基优化

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中国生物防治学报 2024年第4期40卷 894-904页

作者：竺利红邱海萍项慧娟刘浩施跃峰袁玉伟浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所杭州市淳安县石林镇人民政府天津科技大学生物工程学院

茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃干腐病是目前山核桃林最为严重的病害之一。菌株ZL34是从山核桃根系中分离到的一株对茶藨子葡萄座腔菌有较强抑菌活性的内生细菌，为明确其分类地位、抑菌活性和优化发酵培养基，... 详细信息

茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃干腐病是目前山核桃林最为严重的病害之一。菌株ZL34是从山核桃根系中分离到的一株对茶藨子葡萄座腔菌有较强抑菌活性的内生细菌，为明确其分类地位、抑菌活性和优化发酵培养基，采用形态学观察、生理生化特征研究及分子生物学方法对菌株ZL34进行种属鉴定；采用平板对峙法和杯碟法测定了菌株ZL34的抗菌谱；采用插片法、生长速率法和琼脂平板法测定了菌株ZL34对茶藨子葡萄座腔菌的抑菌活性；采用正交试验优化其发酵配方。结果表明，菌株ZL34为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis，其不仅对茶藨子葡萄座腔菌具有较强的抑菌活性，还对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等多种病原真菌和细菌具有较强的抑菌活性。菌株ZL34发酵上清液可显著抑制茶藨子葡萄座腔菌菌丝的生长，其中5倍稀释液的抑制率为96.48%，但对孢子的萌发率无明显影响。受抑制的菌丝色素积累明显，其中气生菌丝表现为异常突起和膨大，形成孔洞，基内菌丝产生大量的分生孢子。筛选到由4%黄豆饼粉、4%玉米粉、0.5%尿素、0.6%（NH4）2HPO4、0.35%CaCO3和pH7.0组成的发酵配方，发酵液活菌量为6.97×10～9 CFU/mL，比优化前提高了44.79%，上清液20倍稀释液对茶藨子葡萄座腔菌的抑菌率为87.16%，比优化前提高了45.41%。本研究表明，贝莱斯芽胞杆菌ZL34对茶藨子葡萄座腔菌菌丝的生长有较强抑制作用，并建立了高产芽胞和高活性的发酵配方，为山核桃干腐病生防制剂的开发提供了研究基础。

关键词：茶藨子葡萄座腔菌贝莱斯芽胞杆菌鉴定抑菌活性山核桃

山核桃干腐病菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测体系的建立

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河北农业大学学报 2018年第4期41卷 87-91,100页

作者：童琪张佳星张宇张传清吴莹莹王叶青浙江农林大学植物保护系浙江临安311300 浙江农林大学林业与生物技术学院浙江临安311300 浙江农林大学农业与食品科学学院浙江临安311300

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反... 详细信息

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg^(2+)为4 mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64℃)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL。

关键词：山核桃干腐病茶藨子葡萄座腔菌环介导等温扩增技术(LAMP)

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山核桃干腐病病原菌的鉴定

浙江农林大学学报 2014年第2期31卷 238-245页

作者：王璇马良进吕全孟娴静张星耀浙江农林大学林业与生物技术学院浙江临安311300 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所/国家林业局森林保护学重点实验室北京100091

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离... 详细信息

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离得到了山核桃干腐病相关病原菌,通过比较其形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列特征,将分离得到的供试菌株分为3组。根据形态学特征和基于ITS序列的系统发育分析,3组菌株分别鉴定为Botryosphaeria dothidea,***和***。其中***为优势菌株,分离频率为71.42%,***和***分离频率分别为14.28%。经致病性测定,上述分离菌株均能引起健康山核桃Carya cathayensis枝条发病,但致病性存在差异。在山核桃上发现的***和***为首次报道。

关键词：森林保护学经济林学溃疡病葡萄座腔菌科茶藨子葡萄座腔菌系统发育山核桃

泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选

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云南农业大学学报（自然科学版） 2016年第4期31卷 624-629页

作者：陈丽华张家恒吴毅歆何鹏飞刘凌闫争亮何月秋云南农业大学植物保护学院云南昆明650201 云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201 微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心云南昆明650217 云南省林业科学院云南昆明650204

为明确泡核桃干腐病的病原和筛选合适的化学防治药剂,从云南省楚雄州大姚县核桃病害标本中分离和鉴定了病原菌,测定了8种杀菌剂的毒力。通过柯赫氏法则验证,确定分离得到的该菌株能侵染泡核桃,产生干腐症状。依据形态特征和r DNA-ITS序... 详细信息

为明确泡核桃干腐病的病原和筛选合适的化学防治药剂,从云南省楚雄州大姚县核桃病害标本中分离和鉴定了病原菌,测定了8种杀菌剂的毒力。通过柯赫氏法则验证,确定分离得到的该菌株能侵染泡核桃,产生干腐症状。依据形态特征和r DNA-ITS序列分析,将病原鉴定为茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。室内毒力测定的结果表明:8种杀菌剂的EC50从大到小依次为氟啶胺0.060 4 mg/L、戊唑醇0.169 0 mg/L、苯醚甲环唑0.177 8 mg/L、嘧菌酯0.476 9 mg/L、福美双2.094 7 mg/L、噻呋酰胺3.961 0 mg/L、异菌脲4.219 0 mg/L、霜脲氰101.764 3 mg/L。

关键词：泡核桃干腐病茶藨子葡萄座腔菌杀菌剂毒力测定

山核桃CcTLP家族鉴定及其在病原菌响应中的功能初探

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山核桃CcTLP家族鉴定及其在病原菌响应中的功能初探

作者：李佩佩浙江农林大学

学位级别：硕士

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)营养物质丰富,已成为林农的主要收入来源,但在生产过程中出现干腐病、根腐病等病害。类甜蛋白(Taumatin-like proteins,TLPs)是参与植物病原菌防御过程的重要蛋白,但在山核桃中发挥何种功能尚未可知。... 详细信息

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)营养物质丰富,已成为林农的主要收入来源,但在生产过程中出现干腐病、根腐病等病害。类甜蛋白(Taumatin-like proteins,TLPs)是参与植物病原菌防御过程的重要蛋白,但在山核桃中发挥何种功能尚未可知。本文结合多种手段对该基因家族的功能进行了研究。主要研究结果如下:(1)山核桃CcTLP家族含有40条基因,系统发育分析显示这些基因分为3类。该家族大部分基因编码的蛋白含有8个稳定的二硫键,G-X-[GF]-X-C-X-T-[GA]-D-C-X(1,2)-G-X-(2,3)-C的保守序列和REDDD的完整结构。(2)进化树分析发现与拟南芥三个类甜蛋白基因同源性较高的山核桃基因有9个。外源激素处理山核桃幼苗叶片,通过qRT-PCR,发现这9个山核桃基因中在SA处理后上调,而对外源MeJA/ETH处理响应较不一致,上调趋势不显著。(3)茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)接种山核桃茎后,接种部位出现明显的黑色病斑,9个CcTLP基因中的7个CcTLP基因的表达量显著上调。接种7天后,植物体内的JA和H2JA的含量显著升高,而JA-Phe,SA与SAG的含量显著下降。SA相关基因的表达量于早期被诱导上调,而JA相关基因表达模式不同,JA负调控因子JAZ基因的表达量在接种后7天为最小值。(4)烟草亚细胞定位分析显示大部分CcTLP蛋白定位于细胞膜与细胞质上。(5)CcTLP30异源表达拟南芥株系对丁香假单胞菌pst DC3000与***的抗性显著增强,然而对灰霉菌(Botrytis cinerea)的抗性显著降低。同时,过表达株系接种病原菌后,体内ROS积累水平也显著提高。综上所述,山核桃TLP家族含有40个成员,其中9个CcTLP基因对激素SA,JA,ETH和病原菌***有不同的响应。***接种山核桃,在早期可能通过SA信号调控CcTLP的表达介导其抗病性,而在后期通过JA。ROS可能在过表达CcTLP30植株响应病原菌时发挥作用。此研究对山核桃CcTLPs家族成员的抗病功能进行了初步探究,为今后山核桃分子育种改良提供指导。

关键词：山核桃茶藨子葡萄座腔菌 TLP基因激素亚细胞定位

Botryosphaeria dothidea侵染后山核桃酚类物质合成相关酶活及关键基因的表达特性

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Botryosphaeria dothidea侵染后山核桃酚类物质合成相关酶活及关...

作者：费莉玢浙江农林大学

学位级别：硕士

茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是引起山核桃干腐病的病原菌,易侵染枝干部位,造成全株死亡,导致严重经济损失。抗病品种的培育过程中发现分别以湖南山核桃和美国山核桃为砧木、浙江山核桃为接穗的嫁接苗抗性好、产果率高,... 详细信息

茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是引起山核桃干腐病的病原菌,易侵染枝干部位,造成全株死亡,导致严重经济损失。抗病品种的培育过程中发现分别以湖南山核桃和美国山核桃为砧木、浙江山核桃为接穗的嫁接苗抗性好、产果率高,目前已广泛种植,但关于其抗病机理还缺乏研究。前期研究发现发病严重的山核桃体内酚类物质以及相关酶——苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)都比抗病山核桃品种中含量低,这些指标对抗病性的鉴定起重要作用,因此还需要对山核桃受***侵染后抗性反应中酚类物质的合成开展进一步的研究。本研究以湖南嫁接山核桃(HG)、美国嫁接山核桃(AG)和浙江山核桃(ZJ)为材料,对接种***后不同品种山核桃的感病情况和侵染状况做分析;测定了不同品种中总酚、总黄酮的含量,并对与防御相关的酶活(PAL、PPO、POD、肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)、细胞壁水解酶)进行了分析;同时对山核桃防御途径中苯丙烷代谢途径的几个关键基因:苯丙氨酸解氨酶基因(PAL基因)、肉桂酸-4-羟基化酶基因(C4H基因)、4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL基因)4CL和查尔酮合成酶(CHS基因)进行了克隆与序列分析,对不同侵染时期基因的表达动态进行了研究。主要结果如下:1.人工接种***后浙江山核桃最易感病,湖南嫁接山核桃最抗病。山核桃的感病程度依次为:ZJ>AG>HG。扫描电镜观察到,***菌丝在寄主表面的伤口发生侵染,前期菌丝附着在寄主表面;中期时菌丝侵入表皮结构,在表皮层中逐渐扩展形成网状;后期菌丝进入到组织结构内,包裹组织结构,破坏组织形态。同一时期感病品种受侵染情况比抗病品种严重。***侵染后,HG的总酚、总黄酮含量显著高于ZJ,AG的含量则略低于HG。苯丙烷代谢途径的关键酶PAL在三个品种中都出现先上升后下降的趋势,但抗病品种接种后酶活性快速积累,显著高于感病品种。HG在接种后POD和PPO活性都表现出升高,而ZJ品种无明显的波动变化。HG和AG中β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)受到诱导后呈上升趋势,相反ZJ表现出下降的反应。接种后所有品种的几丁质酶都呈波动的变化,品种间活性相差不大,诱导抗性的行为不明显。3.通过PCR技术和RACE实验获得了山核桃PAL、C4H、4CL和CHS基因的全序列,结果显示:山核桃PAL基因的开放阅读框为2160 bp,可编码720个氨基酸;C4H基因含有长1521 bp的ORF,编码507个氨基酸;4CL基因含有1个长1638 bp的ORF,能编码545个氨基酸;CHS基因序列,包含了长1170 bp的开放阅读框,可编码389个氨基酸。同源性比对分析结果显示,这四个基因的核苷酸序列在三个品种中的相似度高达97%以上,均与来自胡桃科核桃属植物的序列同源性较高,在90%左右,与其他科属植物同源性在70%-85%之间。系统发育树分析发现山核桃基因序列与胡桃科聚为一支,其他为同一科的聚在一起,木本植物与草本植物的基因进化存在一定距离。4.通过实时荧光定量PCR实验测定了***侵染后不同品种山核桃苯丙烷代谢途径关键基因(PAL、C4H、4CL和CHS)的表达动态。PAL基因在接种前期均呈现上调表达,并且山核桃的抗性越强,PAL基因表达量越大且表达时间越早。在病原菌的胁迫下,C4H基因的表达量迅速上调,嫁接品种AG和HG均在第3 d达到峰值,分别是ZJ的9.3倍和9倍。接种后4CL基因表达量存在一定差异,ZJ的相对表达量较低。山核桃抗性越好,4CL基因的表达量越高,并且接种5 d后该基因表达量也能维持在较高水平。CHS基因是类黄酮合成的关键基因,3个品种中湖南嫁接山核桃的表达显著高于其他两个品种。实验结果与山核桃不同品种酮类物质的积累以及发病情况相一致。

关键词：茶藨子葡萄座腔菌嫁接山核桃酚类化合物苯丙烷代谢途径基因表达