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茶尺蠖触角高丰度气味结合蛋白EoblOBP9、EoblOBP11的配基结合功能和模式差异研究

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茶叶科学 2021年第5期41卷 643-653页

作者：严玉婷吴帆张亚丽傅晓斌崔宏春韩宝瑜李红亮中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018 中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院浙江杭州310016 杭州市农业科学研究院浙江杭州310024

茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)是茶园重要的鳞翅目害虫,雄雌成虫能通过嗅觉系统感受和分辨外界环境的化学信息以助于其交尾和产卵地选择等行为。在此过程中,成虫触角高丰度表达的气味结合蛋白(Odorant-binding proteins,OBPs)可能发... 详细信息

茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)是茶园重要的鳞翅目害虫,雄雌成虫能通过嗅觉系统感受和分辨外界环境的化学信息以助于其交尾和产卵地选择等行为。在此过程中,成虫触角高丰度表达的气味结合蛋白(Odorant-binding proteins,OBPs)可能发挥了重要作用。以茶尺蠖成虫触角高丰度表达的两个OBPs即EoblOBP9和EoblOBP11为对象,首先发现二者cDNA编码蛋白均含有OBPs家族的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸,等电点预测分别为酸性和碱性,表明二者在一级结构性质上存在差异;利用原核表达技术获得重组蛋白,并免疫小鼠制备相应的多克隆抗体,再利Western blot技术验证了二者在雄性成虫触角特异表达;通过荧光竞争结合实验分别测试二者与20种候选配基的结合力,结果表明二者均与两个性信息素成分(顺3,9-环氧-6,7-十八碳二烯与顺-3,6,9-十八碳三烯)及一种植物挥发物成分(反-2-己烯醛)呈现较强的亲和力。与此同时,二者也显示出不同的配基结合谱,如EoblOBP9与1-戊烯-3-醇、苯甲醇、苯乙酮和苯甲醛亲和力较强,结合谱较宽;而EoblOBP11与α-萜品醇亲和力较强,结合更显专一,分子对接结果也支持该结论。此外,预测二者的活性位点均位于C端,也显示出二者配基结合的共性。研究结果表明,尽管这两个茶尺蠖OBPs均在成虫触角高丰度特异表达,但无论从结构性质上还是生化结合谱上,既有保守性又存在差异性,显示出茶尺蠖触角高丰度表达OBPs功能模式的丰富度和多样性,这为解释茶尺蠖嗅觉系统在面对复杂多变的外界环境的适应机制提供了理论依据。

关键词：茶尺蠖触角高丰度气味结合蛋白原核表达

茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能

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中国农业科学 2017年第3期50卷 504-512页

作者：冯一璐傅晓斌吴帆崔宏春李红亮中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州市农业科学研究院

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中... 详细信息

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L-1的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L-1。而性信息素成分之一的(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯与EoblPBP2的解离常数KD仅为172.591μmol·L-1,仅小于苯甲醇的解离常数KD 230.880μmol·L-1,而远远大于上述5种气味物质。表明EoblPBP2重组蛋白具有茶尺蠖性信息素成分((Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯)和植物挥发物质广谱结合能力,而其与性信息素的亲和力弱于大部分测试植物挥发物。【结论】EoblPBP2能与包括性信息素成分在内的多种植物挥发物结合,可能是一种具备特殊复合功能的信息素结合蛋白,可用之进一步研究茶尺蠖的性信息素识别和传递途径。

关键词：茶尺蠖信息素结合蛋白原核表达性信息素与茶树挥发物质结合特征

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)的PCR检测方法及其生物活性研究

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林业科学研究 2008年第4期21卷 451-455页

作者：张永安仲国立侯玉霞贡玉梅曲良建王玉珠中国农业大学理学院北京100094 国家林业局科技发展中心北京100714 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所北京100091

根据茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)多角体蛋白基因建立了PCR检测方法,在茶尺蠖子代卵和蛹内检测到EoNPV存在,灵敏度达到1 fg,此方法可用于田间施用EoNPV后茶尺蠖种群带毒检测。PCR方法由于操作简单、检测灵敏度高、特异性好、重复性好等... 详细信息

根据茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)多角体蛋白基因建立了PCR检测方法,在茶尺蠖子代卵和蛹内检测到EoNPV存在,灵敏度达到1 fg,此方法可用于田间施用EoNPV后茶尺蠖种群带毒检测。PCR方法由于操作简单、检测灵敏度高、特异性好、重复性好等优点,值得应用。利用EoNPV感染茶尺蠖2龄幼虫,幼虫对EoNPV的敏感性很高,测得LC50为2.2×***-l,EoNPV感染浓度越高,则幼虫死亡越快,幼虫死亡时间与感染浓度呈正相关。

关键词： EoNPV 茶尺蠖 PCR检测生物活性

茶尺蠖水通道蛋白EoAQP1的cDNA克隆、多克隆抗体制备及亚细胞定位

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昆虫学报 2016年第4期59卷 382-391页

作者：李良德王定锋刘丰静李慧玲张辉吴光远福建省农业科学院茶叶研究所福建福安355015

【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的... 详细信息

【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布。【方法】采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为Eo AQP1(Gen Bank登录号:KT819587),Eo AQP1 c DNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸。系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,Eo AQP1在鳞翅目昆虫中高度保守。跨膜结构和水分渗透模拟表明,Eo AQP1具有经典的水分渗透模型。qRT-PCR结果表明,Eo AQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著。亚细胞定位结果表明,Eo AQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达。多克隆抗体Western blot检测结果表明,Eo AQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验。【结论】获得了Eo AQP1的c DNA序列,明确了Eo AQP1的生物学特征,阐明了Eo AQP1的时空表达特性,成功制备了Eo AQP1多克隆抗体,初步了解了Eo AQP1的亚细胞定位,为进一步研究Eo AQP1的水分渗透机理奠定了分子基础。

关键词：茶尺蠖水通道蛋白克隆生物信息学表达模式亚细胞定位多克隆抗体

两性生命表研究灰茶尺蠖与茶尺蠖生长发育和繁殖力

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茶叶科学 2022年第6期42卷 828-838页

作者：葛繁星史凡程春喜陈李林福建农林大学安溪茶学院福建安溪362406 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室福建农林大学植物保护学院福建福州350002 中国白茶研究院福建福鼎355200 福建农林大学生命科学学院福建福州350002

灰茶尺蠖[Ectropisgrisescens(Warren)]与茶尺蠖[Ectropisobliqua(Prout)]为茶园两种重要的食叶性害虫,严重影响茶叶的产量和品质。利用年龄-阶段两性生命表,在室内测定两种尺蠖的生长发育指标及年龄-阶段特征存活率、雌成虫年龄-阶段... 详细信息

灰茶尺蠖[Ectropisgrisescens(Warren)]与茶尺蠖[Ectropisobliqua(Prout)]为茶园两种重要的食叶性害虫,严重影响茶叶的产量和品质。利用年龄-阶段两性生命表,在室内测定两种尺蠖的生长发育指标及年龄-阶段特征存活率、雌成虫年龄-阶段特征繁殖力、年龄-阶段特征寿命期望值、年龄-阶段特征繁殖值和种群参数,并分析各参数的差异。结果表明,灰茶尺蠖的1、2、4、5龄幼虫发育历期、幼虫总历期、蛹期及成虫寿命(分别为3.22、2.55、1.43、4.56、15.34、7.98、7.59 d)均显著低于茶尺蠖(分别为4.07、3.05、2.16、5.71、18.83、8.88、10.65 d);灰茶尺蠖2~5龄幼虫存活率(分别为100.00%、95.00%、62.00%和96.00%)均高于茶尺蠖(分别为93.00%、71.00%、45.00%和80.00%);灰茶尺蠖平均世代周期(32.412 d)显著短于茶尺蠖(36.016 d)。灰茶尺蠖年龄-阶段特征存活率、内禀增长率比茶尺蠖高,平均世代周期(T)比茶尺蠖短,其种群能更迅速扩增。研究结果为灰茶尺蠖和茶尺蠖室内种群饲养提供基础数据,为两近缘种的竞争机制及种群控制策略选择提供理论依据。

关键词：灰茶尺蠖茶尺蠖年龄-阶段两性生命表存活率繁殖力

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茶尺蠖雄成虫生殖系统形态学与组织学观察

茶叶科学 2015年第6期35卷 527-533页

作者：张家侠孙钦玉赵强夏先江丁勇安徽省农业科学院茶叶研究所安徽祁门245600

通过常规解剖和石蜡切片显微技术对茶树主要害虫之一茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)雄成虫的内外生殖器官进行了形态观察和结构特征的定位描述。茶尺蠖雄成虫外生殖器由抱握器、背兜、爪形突和阳具组成;内生殖器由1个精巢、1对贮精囊、... 详细信息

通过常规解剖和石蜡切片显微技术对茶树主要害虫之一茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)雄成虫的内外生殖器官进行了形态观察和结构特征的定位描述。茶尺蠖雄成虫外生殖器由抱握器、背兜、爪形突和阳具组成;内生殖器由1个精巢、1对贮精囊、1对输精管、1对附腺和单个射精管组成,组织结构与鳞翅目其他种基本一致;经切片观察发现,精巢由8个呈辐射状精巢小管组成,它们之间被一薄层结缔组织分隔开,其内分布大量的精原细胞、精母细胞和成熟的精子束;贮精囊和输精管内均充满液体,其中贮精囊内可见大量的精子束。描述茶尺蠖雄成虫生殖系统结构特征,明确精子束在组织内的填充状态等特征,对其田间预测预报、系统发育,以及种间鉴定等均有一定的指导意义。

关键词：茶尺蠖雄成虫生殖器官形态超微结构

茶尺蠖和灰茶尺蠖内共生菌Wolbachia的分子检测及序列分析

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应用昆虫学报 2016年第4期53卷 782-792页

作者：周孝贵付建玉刘守安毛腾飞肖强陈学新浙江大学昆虫科学研究所杭州310058 中国农业科学院茶叶研究所杭州310008 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室杭州310008

【目的】对茶尺蠖Ectropis obliqua及其近缘种灰茶尺蠖***体内共生菌Wolbachia进行分子鉴定,确定两者体内Wolbachia的感染率及其进化地位,为进一步探讨其对茶尺蠖和灰茶尺蠖的潜在影响提供科学依据。【方法】采用Wolbachia的16S r RNA、... 详细信息

【目的】对茶尺蠖Ectropis obliqua及其近缘种灰茶尺蠖***体内共生菌Wolbachia进行分子鉴定,确定两者体内Wolbachia的感染率及其进化地位,为进一步探讨其对茶尺蠖和灰茶尺蠖的潜在影响提供科学依据。【方法】采用Wolbachia的16S r RNA、fts Z和wsp基因特异性引物,通过PCR扩增法检测了我国3个茶尺蠖地理种群（浙江杭州、余杭和江苏无锡）和3个灰茶尺蠖地理种群（浙江新昌、湖北浠水和江西南昌）中Wolbachia的感染情况,并进行测序和序列分析。【结果】茶尺蠖和灰茶尺蠖都感染了Wolbachia,灰茶尺蠖的Wolbachia感染率为100%,但茶尺蠖的Wolbachia感染率在22%-95%,且PCR产物电泳得到的条带微弱。wsp序列在茶尺蠖和灰茶尺蠖种间、种内无差异;但16S r RNA序列在茶尺蠖和灰茶尺蠖种间、种内差异为0.362%-0.727%之间;茶尺蠖样本未成功扩增出fts Z序列,灰茶尺蠖样本获得2条fts Z基因序列差异为1.647%。基于Wolbachia的16S r RNA和wsp基因构建的系统发育树表明,本研究中茶尺蠖和灰茶尺蠖种群所感染的Wolbachia全部属于B组的Pip亚组。【结论】茶尺蠖和灰茶尺蠖均被B组Pip亚组的Wolbachia感染,但感染率相差很大,这为研究Wolbachia对茶尺蠖和灰茶尺蠖生物学及生态学的影响奠定了基础。

关键词：茶尺蠖灰茶尺蠖 Wolbachia 16S rRNA ftsZ wsp 序列分析

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茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

茶叶科学 2018年第2期38卷 133-139页

作者：冉伟张瑾张新蔺松波孙晓玲中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室浙江杭州310008

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12 h显著诱导了Cs ANR基因的相对... 详细信息

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12 h显著诱导了Cs ANR基因的相对表达水平,且在为害后3 h和12 h达到了极显著差异。Cs LAR基因在茶尺蠖为害后6 h和12 h,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24 h显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48 h仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24 h和48 h均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。

关键词：茶尺蠖取食儿茶素诱导茶树

茶尺蠖脂肪酶合成基因EoL2的克隆和组织表达特征

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中国生物防治学报 2015年第1期31卷 48-56页

作者：杜琴辛肇军杨子威李喜旺陈宗懋孙晓玲中国农业科学院茶叶研究所/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室杭州310008

昆虫脂肪酶可参与脂类消化、吸收和运输,并能介导植物的抗病虫功能。本研究通过茶尺蠖唾液腺转录组数据库发掘到该基因片段,采用RACE技术克隆获得了一条茶尺蠖脂肪酶合成基因序列,命名为Eo L2,并检测了其在茶尺蠖不同生育期及不同组织... 详细信息

昆虫脂肪酶可参与脂类消化、吸收和运输,并能介导植物的抗病虫功能。本研究通过茶尺蠖唾液腺转录组数据库发掘到该基因片段,采用RACE技术克隆获得了一条茶尺蠖脂肪酶合成基因序列,命名为Eo L2,并检测了其在茶尺蠖不同生育期及不同组织部位中的相对表达水平。研究结果表明,Eo L2的c DNA序列全长1310 bp,开放阅读框为1041 bp,编码一个包含346个氨基酸的蛋白,推测该蛋白相对分子量为37.96 k D,推测等电点(PI)为8.41,具有脂肪酶典型的GXSXG丝氨酸活性保守序列,其氨基酸序列与家蚕相似度最高,为57%。实时荧光定量PCR结果表明,Eo L2在卵中的表达量显著低于其它虫态;在1龄幼虫期的相对表达水平显著高于2~5龄;在成虫中的表达量显著高于蛹;在血淋巴中的表达量显著高于中肠、表皮、脂肪体和唾液腺。

关键词：茶尺蠖脂肪酶基因克隆表达谱