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苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

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果树学报 2010年第5期27卷 752-756页

作者：宋艳苏郑银英李丽娜王国平洪霓华中农业大学植物科学技术学院湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室武汉430070 石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室新疆石河子832003

构建了来源于梨的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)分离物P-4-1-69和P-L2的原核表达载体pET-P-4-1-69和pET-P-L2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1 mmol.L-1 IPTG下诱导表达。SDS-PAGE和用商业化ASGV抗体对诱导表达产物进行Western Blot分析结果表明,2个分离物的外壳蛋白基因(cp基因)在大肠杆菌中成功地进行了高效表达,重组外壳蛋白的大小约为31 ku。分别用含分离物P-4-1-69和P-L2的重组外壳蛋白的胶条免疫大耳白兔,制备了抗ASGV重组外壳蛋白的抗血清。采用间接ELISA法用所制备的抗血清对回收的重组外壳蛋白进行检测,当抗分离物P-4-1-69和P-L2的重组外壳蛋白的抗血清分别稀释512 000倍和64 000倍时,检测结果仍为阳性。Western Blot分析和组织免疫印迹检测(Tissue blotting immunoassay,TBIA)结果表明,纯化的抗体具有较强的特异性,可有效检测梨样品中的ASGV。

关键词：苹果茎沟病毒 cp基因原核表达抗血清

苹果茎沟病毒KRL-1分离物外壳蛋白基因序列测定

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果树学报 2005年第5期22卷 576-578页

作者：郭立新向本春陈红运段维军朱水芳石河子大学农学院植物病理教研室新疆石河子832003 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所北京100029

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸... 详细信息

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸同源性为90%-93%,氨基酸同源性为94%-98%。根据KRL-1与其他分离物CP基因序列和生物学症状上的差异,可推断KRL-1存在较大的分子变异。

关键词：苹果茎沟病毒外壳蛋白基因克隆序列分析

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苹果茎沟病毒RT-PCR检测技术

西北农业学报 2006年第4期15卷 105-107页

作者：李文慧牛建新石河子大学农学院园艺系石河子832003

用苹果的叶片作为材料,研究比较了两种提取苹果总RNA方法的效果,确定了较好的提取方法。根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因设计引物,通过RT-PCR扩增在苹果叶片总RNA样品中获得了524 bp的特异片断,通过对该片段的序列分析与苹果茎沟病毒外壳... 详细信息

用苹果的叶片作为材料,研究比较了两种提取苹果总RNA方法的效果,确定了较好的提取方法。根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因设计引物,通过RT-PCR扩增在苹果叶片总RNA样品中获得了524 bp的特异片断,通过对该片段的序列分析与苹果茎沟病毒外壳蛋白基因源序列比较,其同源性高达93%。通过多次重复实验验证,该方法能很好地检测苹果茎沟病毒。

关键词：苹果茎沟病毒逆转录-聚合酶链式反应克隆序列分析

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苹果茎沟病毒侵染对嘎拉苹果果实品质的影响

中国果树 2023年第3期 18-22页

作者：贾晓君胡国君张尊平范旭东任芳董雅凤中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心辽宁兴城125100

为了明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)侵染对苹果果实品质的影响,以单一接种ASGV的嘎拉苹果盆栽树为材料,测定果实单果重、纵横径、硬度、维生素C、可溶性固形物、糖酸组分、花色苷组分以及香气物质含量等。结果表明,... 详细信息

为了明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)侵染对苹果果实品质的影响,以单一接种ASGV的嘎拉苹果盆栽树为材料,测定果实单果重、纵横径、硬度、维生素C、可溶性固形物、糖酸组分、花色苷组分以及香气物质含量等。结果表明,与健康植株相比,感染ASGV植株的果实纵横径无明显变化,单果重、果实硬度、可溶性固形物含量和可溶性糖含量显著降低,有机酸含量增加,香气组分占比发生改变,果皮中4种花色苷的含量均显著降低。

关键词：苹果苹果茎沟病毒侵染果实品质

苹果茎沟病毒cp基因hpRNA表达载体的构建及其转化烟草研究

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苹果茎沟病毒cp基因hpRNA表达载体的构建及其转化烟草研究

作者：刘辉华中农业大学

学位级别：硕士

病原获得抗性是植物抗病毒基因工程的一个重要策略,即将病毒自身的基因导入植物后,可使该植物对同种及亲缘关系较近的病毒产生抗性,在该策略中应用最早的基因是来自病毒的外壳蛋白基因。大量的研究表明,导入植物的基因转录物可与入侵的... 详细信息

病原获得抗性是植物抗病毒基因工程的一个重要策略,即将病毒自身的基因导入植物后,可使该植物对同种及亲缘关系较近的病毒产生抗性,在该策略中应用最早的基因是来自病毒的外壳蛋白基因。大量的研究表明,导入植物的基因转录物可与入侵的病毒RNA之间相互作用,干扰病毒的侵染或复制,这种抗性主要是基于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)作用。苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)在苹果和梨树上发生极其普遍的一种+ssRNA病毒,在果树上多表现为潜伏侵染,但可导致树势的降低和影响果品质量。同时,该病毒可通过汁液摩擦接种传染至多种草本植物,接种草本寄主植物是研究该病毒生物学特性的常用途径之一。本研究基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用,构建ASGV外壳蛋白基因片段的转录后可形成发夹状RNA(hpRNA)的载体,通过农杆菌介导转化该病毒的草本寄主植物本氏烟,以期为进一步研究hpRNA诱导对同源病毒和异源病毒的抗性及其RNAi特性奠定基础。(1)根据ASGV的CP基因序列特点,设计合成了可扩增该基因近3'端和5'端大小分别为209bp和392bp的两对引物,并在各引物5'端引入两个酶切位点。以本实验室保存的一个ASGV分离物CP基因克隆的质粒为模板,用所合成两对引物分别扩增获得长度为392bp和209bp的特异片段。通过回收、连接、转化*** DH10B和酶切鉴定,对所获扩增片段进行了克隆。(2)采用所设计酶切位点对应的两对限制性内切酶对含有392bp克隆片段的质粒分别进行双酶切,回收目标片段后与相同双酶切的表达载体pASDS714进行连接和转化大肠杆菌,获得含有392bp片段的正向和反向插入片段的重组质粒pASDS714-392(+)和pASDS714-392(-)然后对获得的pASDS714-392(+)采用另一对酶进行双酶切后与同对酶双酶切获得的392bp片段连接,获得在内含子两端分别含有正向插入和反向插入片段的可表达hpRNA的重组质粒pASDS714-392(hp)。(3)采用同样的方法,构建了ASGV CP基因3'端大小为209bp片段的正向插入和反向插入的重组质粒pASDS714-209(+)和pASDS714-209(-)。(4)将以上所获含392bp反向插入片段和可表达392bp片段的hpRNA的重组质粒分别转化根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌侵染法转化本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶盘,经共培养和抗性筛选,获得pASDS714-392(-)和pASDS714-392(hp)转化的抗性芽系各24和32株。采用CTAB法从获得的各抗性芽系的离体培养植株提取总DNA,利用扩增该片段的特异引物对其6个和13个芽系进行PCR鉴定,前者有3株检测为阳性,后者13株检测结果均为阳性。

关键词：转录后基因沉默苹果茎沟病毒外壳蛋白基因 RNA介导抗性指示植物遗传转化

苹果茎沟病毒对梨树幼苗生长及过氧化物酶活性的影响

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应用与环境生物学报 2003年第6期9卷 655-656页

作者：张咏梅冷怀琼刘畅周国逸中国科学院成都生物研究所成都610041 四川农业大学农业科技学院四川雅安625014 眉山县农业局四川眉山710062 中国科学院华南植物研究所广州510650

Based on growth level and peroxidase activity,a comparative study and paried-samples t test were made between virus-free Zaosu pear seedlings and the seedlings inoculated with apple stem grooving virus(ASGV). The results showed : (1) virus-free Zaosu pear seedlings grew better than inoculated ones. Of the seedlings the height,diameter,branches and autumn braches differed statistically significantly; (2)the peroxidase activity of inoculated seedlings was higher than that of virus-free ones,and the peak of peroxidase activity occurred on about d 7 and d 24 after inoculation. Fig 1,Tab 1,Ref

关键词：梨苹果茎沟病毒生长量过氧化物酶活性

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苹果茎沟病毒传播途径研究

苹果茎沟病毒传播途径研究

作者：曹晓凤河北农业大学

学位级别：硕士

苹果病毒具有危害性强、传播扩散快和难以治愈等特点。目前苹果病毒的危害在我国苹果生产上呈现上升势头,苹果茎沟病毒是潜隐性病毒中危害重、脱除难的重要病毒之一,研究该病毒传播途径,尤其是明确种子传毒的几率迫在眉睫。本试验以携... 详细信息

苹果病毒具有危害性强、传播扩散快和难以治愈等特点。目前苹果病毒的危害在我国苹果生产上呈现上升势头,苹果茎沟病毒是潜隐性病毒中危害重、脱除难的重要病毒之一,研究该病毒传播途径,尤其是明确种子传毒的几率迫在眉睫。本试验以携带苹果茎沟病毒红富士苹果树产的果实及种子为材料,研究了苹果不同部位成熟组织RNA的提取,并以RT-PCR为检测手段研究了此种病毒在果实及种子内部的分布;以携带该病毒的八棱海棠种子为材料,利用RT-PCR为检测手段研究了苹果茎沟病毒的种子传毒率;以脱毒的王林苹果继代组培苗为材料,采用RT-PCR技术为检测手段研究了该病毒是否能通过汁液传播。主要结果如下:1同一提取液提取苹果不同部位总RNA时,植物材料最佳用量不同;不同提取液提取苹果同一部位总RNA时,植物材料最佳用量也不相同。RNAiso Plus和RNAiso-mate for Plant Tissue搭配使用时,植物材料的最佳用量为:种皮0.025g,胚0.05g。使用RNAplant植物总RNA提取试剂时,植物材料最佳用量为:果皮0.075g,果肉0.25g,种皮0.015g,胚0.025g。2苹果茎沟病毒侵染的苹果树生产的果实,其果皮、果肉均携带病毒。3苹果茎沟病毒通过侵染种皮表面组织致使种子带毒,但是种胚不带毒。氢氧化钠或磷酸三钠可以有效灭活种皮表面携带的苹果茎沟病毒,磷酸三钠表面处理后,种子的发芽率显著高于氢氧化钠处理后种子的发芽率。4苹果茎沟病毒在八棱海棠上可以通过种子传播,携带有该病毒的母树生产的种子实生苗带毒率为5.89‰。5在组织培养条件下,ASGV可以通过汁液进行传播,通过汁液传播的几率为2.08﹪。

关键词：苹果茎沟病毒传播途径种子传毒 RT-PCR

苹果茎沟病毒在苹果—腐皮镰刀菌间相互传播的研究

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苹果茎沟病毒在苹果—腐皮镰刀菌间相互传播的研究

作者：武雪莉河南农业大学

学位级别：硕士

中国是世界上最大的苹果栽培国家,而国内大多数苹果园都存在多种病毒性病害,极大影响我国苹果产业发展。苹果病毒病在田间主要以嫁接、机械修剪进行传播,树体一旦感染病毒,将终生携带病毒。苹果茎沟病毒在果园内的发生非常普遍,对果树... 详细信息

中国是世界上最大的苹果栽培国家,而国内大多数苹果园都存在多种病毒性病害,极大影响我国苹果产业发展。苹果病毒病在田间主要以嫁接、机械修剪进行传播,树体一旦感染病毒,将终生携带病毒。苹果茎沟病毒在果园内的发生非常普遍,对果树危害也极其严重,且防治困难。然而目前人们对于苹果病毒病在宿主以外的传播途径并不十分清楚,但是已经有报道证明真菌可以作为一种潜在的媒介传播植物病毒,且极少数真菌病毒已被证实可以降低病原真菌对寄主的毒力,所以阐述病毒传播途径并进行有效防控,对国内外苹果病毒病的防治具有重要意义。实验室在前期真菌病毒的检测中发现一些腐皮镰刀菌中含有苹果茎沟病毒,所以本研究以苹果茎沟病毒与腐皮镰刀菌为主要研究对象,通过对苹果根系内生真菌的分离与菌种鉴定、高通量测序技术以及真菌侵染植物等手段筛选鉴定得到了携带植物病毒的腐皮镰刀菌菌株Fga1;通过高通量测序发现该菌株除了含有真菌病毒的遗传物质以外,还含有植物病毒苹果茎沟病毒的基因组RNA。我们以此为基础,更加深入地研究了ASGV在植物与病原真菌之间的跨界传播,为苹果病毒病的早期检测和预防提供新的思路;同时也探究了ASGV对菌株致病力的影响以及ASGV与腐皮镰刀菌两者同时侵染植株时对植株生理生化特征的影响,具体研究结果如下:1、在苹果根系内生真菌的筛选与鉴定过程中,我们发现了6株携带病毒的腐皮镰刀菌菌株,分别为Fg3、Fg4、Fg7、Fg9、Fg11和Fga1,通过提取真菌双链RNA得知菌株Fga1中含有苹果茎沟病毒（ASGV）的基因组RNA,通过对高通量测序结果的分析发现该病毒与植物来源的病毒ASGV-Fny高度同源。2、利用感染ASGV的苹果病叶汁液以及携带ASGV的菌株Fga1的总RNA摩擦接种本氏烟草叶片的试验证明了真菌来源的病毒GV-Fg和植物来源的病毒ASGV-Fny两者均可以侵染烟草植株,且均会引起烟草植株系统叶片出现褪绿、黄绿相间的症状;通过RT-PCR检测发现两者均可以在烟草中进行复制。3、通过真菌孢子接种试验发现植物病毒ASGV侵染腐皮镰刀菌之后并不会使菌株表型产生明显变化;但会对菌株的生长速度造成一定的影响,即携带病毒的菌株Fg/ASGV-Fny生长速度会稍快于无毒菌株Fg/ds F,因此证明ASGV-Fny的存在可能会加快菌株的生长。4、通过模拟自然环境,分别以本氏烟草和苹果植株为研究材料设置相关试验证实了腐皮镰刀菌与苹果茎沟病毒两者之间存在一种新的跨界传播途径,即腐皮镰刀菌可以将ASGV传播给健康的植株,同时无毒的腐皮镰刀菌也可以从患病植株中获取到植物病毒ASGV;由此建立了病毒-真菌-植物的互作体系,验证了ASGV在植物与真菌之间的双向传播。5、通过RT-PCR检测发现植物来源的病毒ASGV-Fny可以在腐皮镰刀菌菌株中稳定存在;菌株对峙培养试验证明了植物来源的病毒ASGV-Fny与真菌来源的病毒GV-Fg两者均可以通过菌丝融合的方式在菌株中进行水平传播,也可以通过产生的游动孢子进行垂直传播。6、在验证病毒与真菌跨界传播研究的试验中发现病毒ASGV-Fny和病原真菌混合侵染时,烟草植株茎部发黑、腐烂的症状会更加严重,且植株明显萎蔫,接近死亡;病毒ASGVFny和病原真菌混合侵染下的苹果植株生长力明显降低,由此证明植物病毒ASGV的存在可能会使腐皮镰刀菌的致病力增强。7、在探究植物病原真菌与植物病毒ASGV互作关系的试验中发现,病毒ASGV-Fny和病原真菌混合侵染植株时植株的生长更加缓慢,且ASGV与腐皮镰刀菌混合作用下植株根系的总面积、根长、总体积、根尖数、分叉数量以及最大直径与对照相比分别降低了29.8%、49.6%、28.7%、54.2%、52.1%、26.5%;除此之外,两者混合侵染时植株叶片的叶绿素荧光值QY平均下降87.7%,总叶绿素含量下降91.2%,这些结论充分证明了植物病毒与病原真菌混合侵染会促进植物病害的发生与发展。本研究筛选鉴定获得携带苹果茎沟病毒的腐皮镰刀菌菌株Fga1,并验证了ASGV可以跨界侵染腐皮镰刀菌;同时建立了病毒-真菌-植物的互作体系,验证了植物病毒ASGV跨界侵染真菌的新型传播方式;还发现当植物病毒与病原真菌混合侵染植株时会促进植物病害的暴发。以上结果为进一步研究苹果病毒病的传播提供了新的思路和理论基础,同时也为研究植物病毒与植物病原真菌之间的相互作用提供了方向,并且为创建新型植物真菌病害的生防因子提供了科学依据。

关键词：苹果茎沟病毒腐皮镰刀菌跨界传播混合侵染

侵染牡丹的苹果茎沟病毒分离物基因组测序及分析

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园艺学报 2023年第12期50卷 2735-2747页

作者：陈玲郭铖贾安宁邓丛良种焱史喜菊李永强北京林业大学草业与草原学院北京100083 北京农学院生物与资源环境学院北京102206 中国海关科学技术研究中心北京100026

前期在北京地区种植的牡丹中检测到了苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV),并获得了1个ASGV牡丹分离物的基因组全序列。为分析侵染牡丹的ASGV的遗传多样性,根据已报道的118个ASGV基因组全序列的保守区设计特异性引物,用重叠(o... 详细信息

前期在北京地区种植的牡丹中检测到了苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV),并获得了1个ASGV牡丹分离物的基因组全序列。为分析侵染牡丹的ASGV的遗传多样性,根据已报道的118个ASGV基因组全序列的保守区设计特异性引物,用重叠(overlapping)RT-PCR和cDNA末端序列快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得9个ASGV牡丹分离物的基因组全序列。共计10个ASGV牡丹分离物,基因组全序列成对比对的核苷酸一致性为81.9%~97.6%,与其他物种ASGV分离物基因组全序列的核苷酸一致性为80.8%~91.2%。序列分析表明ASGV牡丹分离物的分子多样性主要位于多聚蛋白的保守结构域Mtr和P-Pro之间以及RdRp与CP之间。用127个ASGV基因组全序列进行重组分析,5个牡丹分离物被鉴定为重组体,其中1个重组体的重组亲本来源于不同国家的不同寄主植物。用79个非重组的ASGV基因组全序列构建系统发育树,表明ASGV牡丹分离物与ASGV苹果、梨和柑橘等分离物共同聚类到第Ⅰ组,且ASGV牡丹分离物聚到不同的分支。研究结果表明侵染牡丹的ASGV具有遗传多样性,重组可能是导致其遗传多样性的一个因素。

关键词：苹果茎沟病毒牡丹基因组全序列序列分析重组系统发育