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苯酚羟化酶基因工程菌表达优化及特性研究

环境科学学报 2012年第7期32卷 1549-1556页

作者：曹湘禹黄益养时胜男马桥李新亮孔春雷沈娥曲媛媛大连理工大学环境学院工业生态与环境工程教育部重点实验室大连116024 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室哈尔滨150090

利用表面响应法优化苯酚羟化酶基因工程菌(PH_IND)的生长条件(种龄、接种量)及表达条件(诱导OD600、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度),并对其粗酶特性进行考察.实验结果表明,菌株PH_IND的最佳生长条件及表达条件为:种龄7.19h,接种量1.39%... 详细信息

利用表面响应法优化苯酚羟化酶基因工程菌(PH_IND)的生长条件(种龄、接种量)及表达条件(诱导OD600、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度),并对其粗酶特性进行考察.实验结果表明,菌株PH_IND的最佳生长条件及表达条件为:种龄7.19h,接种量1.39%,诱导OD6000.54,IPTG浓度0.19mmol·L-1,诱导时间2.37h,诱导温度35℃,此时,苯酚羟化酶最大酶活力为0.6167U·mg-1.粗酶特性分析表明,苯酚羟化酶的最适pH和温度分别为8.0和40℃.Ba2+、Fe3+、Hg2+、Pb2+对苯酚羟化酶有明显促进作用,而Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+对苯酚羟化酶有抑制作用.底物广谱性实验表明,苯酚羟化酶具有极强的芳香化合物降解能力.

关键词：苯酚苯酚羟化酶表面响应法底物多样性

苯酚羟化酶基因工程菌转化4-乙烯基苯酚特性研究

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环境科学与技术 2013年第1期36卷 12-15页

作者：王腾吴英格沈娥杨杰常珂伟时胜男曲媛媛大连理工大学环境学院工业生态与环境工程教育部重点实验室辽宁大连116024 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室黑龙江哈尔滨150090

4-乙烯基苯酚广泛用作食品的调味剂及聚4-乙烯基苯酚类聚合物等的合成。近年来,研究发现4-乙烯基苯酚是苯乙烯在小鼠和人体中的次要代谢物,具有肝毒性和呼吸毒性。因此,利用生物定向转化技术降低4-乙烯基苯酚的毒性将具有实际意义。文... 详细信息

4-乙烯基苯酚广泛用作食品的调味剂及聚4-乙烯基苯酚类聚合物等的合成。近年来,研究发现4-乙烯基苯酚是苯乙烯在小鼠和人体中的次要代谢物,具有肝毒性和呼吸毒性。因此,利用生物定向转化技术降低4-乙烯基苯酚的毒性将具有实际意义。文章考察了含苯酚羟化酶基因的工程菌PH_IND生物转化4-乙烯基苯酚的条件,确定其最优条件为:菌株PH_IND的OD600为2.5,4-乙烯基苯酚的浓度为1 mmol/L,葡萄糖浓度为20 mmol/L,缓冲溶液的pH为8。在该条件下,生物转化呈一级动力学趋势,反应180 min后,转化率为31%。分子对接结果表明,4-乙烯基苯酚可以和苯酚羟化酶大亚基的活性位点结合,液相色谱-质谱联用分析结果表明4-乙烯基苯酚被转化为4-乙烯基儿茶酚。

关键词： 4-乙烯基苯酚苯酚羟化酶生物转化分子对接液相色谱-质谱联用分析

苯酚羟化酶基因工程菌合成靛蓝及其同系物的特性研究

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苯酚羟化酶基因工程菌合成靛蓝及其同系物的特性研究

作者：曹湘禹大连理工大学

学位级别：硕士

靛蓝作为古老色素,广泛应用于医药、印染、食品等行业。微生物法合成靛蓝因其绿色安全、高效、高选择性等特点逐渐受到人们的关注,但其工业化进程十分缓慢。因此,开发新型高效合成靛蓝的酶资源,优化其合成条件,考察其对靛蓝同系物的合... 详细信息

靛蓝作为古老色素,广泛应用于医药、印染、食品等行业。微生物法合成靛蓝因其绿色安全、高效、高选择性等特点逐渐受到人们的关注,但其工业化进程十分缓慢。因此,开发新型高效合成靛蓝的酶资源,优化其合成条件,考察其对靛蓝同系物的合成情况,并对其合成机理进行探讨对微生物合成靛蓝的深入研究具有重要意义。本论文以实验室前期构建的苯酚羟化酶基因工程菌(PHND)为研究对象。首先,对苯酚羟化酶的基因序列进行分析,并考察其粗酶特性;其次,优化该基因工程菌转化吲哚合成靛蓝的转化条件,鉴定其转化产物,推测其转化的代谢途径;最后,考察该基因工程菌转化吲哚同系物合成靛蓝类色素的特性,并对合成的色素进行鉴定。氨基酸序列分析表明苯酚羟化酶含有KLMNOP六个组分,与已知相应组分的序列最高同源性为51-87%,表明该苯酚羟化酶具有一定新颖性。利用表面响应法优化苯酚羟化酶基因工程菌(PHND)的最优生长条件及表达条件为种龄7.19h、接种量1.39%、诱导OD6000.54、IPTG浓度0.19mmol/L、诱导时间2.37h、诱导温度35℃,此时,苯酚羟化酶的最大酶活力为0.6167U/mg。粗酶特性表明：苯酚羟化酶的最适反应pH值为8.0,最适反应温度为40℃,具有一定浓度的NaCl耐受能力。苯酚羟化酶基因工程菌(PHND)合成靛蓝的最佳条件为菌体浓度为OD6002.5,吲哚浓度200mg/L,反应时间6h,在此条件下靛蓝的最大生成量为92.5mg/L。利用HPLC-MS和NMR对转化产物进行鉴定,分别为靛蓝、靛玉红及2-(7-oxo-1H-indol-6(7H)-ylidene) indolin-3-one,并推测出该基因工程菌转化吲哚合成靛蓝的途径,首次报道靛红和7-羟基吲哚在C-2和C-6位聚合生成2-(7-oxo-1H-indol-6(7H)-ylidene) indolin-3-one途径。分子对接模拟和该基因工程菌(PHND)合成靛蓝类色素的广谱性研究都表明除3-甲基吲哚外,该基因工程菌能将大多数吲哚同系物转化,说明该基因工程菌具有较强的底物广谱性。并利用HPLC-MS和NMR等分析手段对转化产物进行鉴定,其合成产物为靛蓝的同系物。

关键词：苯酚羟化酶 PHIND 吲哚靛蓝生物合成

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

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微生物学通报 2015年第11期42卷 2189-2197页

作者：熊彩云许波戴利铭李俊俊唐湘华慕跃林杨云娟周峻沛丁俊美黄遵锡云南师范大学生命科学学院云南昆明650500 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南昆明650500 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南昆明650500 云南师范大学酶工程重点实验室云南昆明650500

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O... 详细信息

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与Gen Bank中相应酶的序列一致性分别介于92%-100%和87%-100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有Lm PH(Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。

关键词：倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶邻苯二酚1 2-双加氧酶多样性

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谷氨酸棒杆菌中苯酚羟化酶的鉴定及功能研究

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第12期43卷 191-198页

作者：杨志方肖潇司美茹成娟丽沈锡辉王瑶西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100 运城学院生命科学系山西运城044000

【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a... 详细信息

【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a中并转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组菌株原核表达,纯化并测定重组蛋白对苯酚的羟化作用。【结果】成功构建了谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,其在以苯酚为惟一碳源和能源的培养基中不能生长,而野生型谷氨酸棒状杆菌能正常生长;pET28a-ncgl 2588重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达分子质量为73ku的目的蛋白,此蛋白酶活为0.37mmol/(min·mg);在以苯酚为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒状杆菌时,苯酚羟化酶得到最高表达,用其他芳香族化合物培养则苯酚羟化酶表达较少;进化树分析发现,谷氨酸棒状杆菌中的苯酚羟化酶与酵母Trichosporon cutaneum中的苯酚羟化酶序列同源性高达43%,远远高于与细菌中苯酚羟化酶的同源性。【结论】谷氨酸棒状杆菌中的ncgl 2588基因编码苯酚羟化酶,且该酶为可诱导酶,在苯酚降解中发挥着重要作用。

关键词：谷氨酸棒状杆菌基因敲除苯酚羟化酶

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苯酚羟化酶的功能与调控研究进展

中国农业科技导报 2010年第5期12卷 36-41页

作者：彭子欣于海英战嵛华陈明林敏张维中国农业科学院生物技术研究所北京100081 中国农业大学生物学院北京100193

苯酚是一种广泛存在的芳香烃污染物,可以被一些环境微生物降解。苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羟化酶催化为邻苯二酚。苯酚羟化酶的转录主要由XylR/DmpR调控蛋白激活,另外在一些多组分苯酚羟化酶操纵子中也发现了起抑制作用的调控... 详细信息

苯酚是一种广泛存在的芳香烃污染物,可以被一些环境微生物降解。苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羟化酶催化为邻苯二酚。苯酚羟化酶的转录主要由XylR/DmpR调控蛋白激活,另外在一些多组分苯酚羟化酶操纵子中也发现了起抑制作用的调控蛋白。综述了苯酚降解菌中苯酚羟化酶的功能和调控机制等方面的研究进展。

关键词：苯酚苯酚羟化酶调控蛋白 XylR/DmpR

浑浊红球菌PD630中苯酚羟化酶基因的鉴定及功能研究

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浑浊红球菌PD630中苯酚羟化酶基因的鉴定及功能研究

作者：李玲华中科技大学

学位级别：硕士

浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)能耐受和降解多种木质素衍生芳香化合物,已被应用于木质素高值转化的研究。苯酚存在于多种木质素的解聚产物中,其亚结构和毒性水平在木质素衍生芳香化合物中具有代表性,是研究木质素衍生芳香... 详细信息

浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)能耐受和降解多种木质素衍生芳香化合物,已被应用于木质素高值转化的研究。苯酚存在于多种木质素的解聚产物中,其亚结构和毒性水平在木质素衍生芳香化合物中具有代表性,是研究木质素衍生芳香化合物降解机制的一种模型化合物。已有很多研究对*** PD630降解苯酚的机制进行了探究,发现PheB1A1(LPD06740/LPD06741)与PheB2A2(LPD06576/LPD06575)可能是*** PD630降解苯酚的关键基因簇,但目前还没有对PheB1A1与PheB2A2进行鉴定及功能研究的报道,限制了对*** PD630降解木质素衍生芳香化合物机制的理解。因此,本文对*** PD630中的PheB1A1与PheB2A2进行了鉴定与功能研究,证实了PheB1A1与PheB2A2是*** PD630中的苯酚羟化酶基因簇。主要研究结果和结论如下:通过实时荧光定量PCR检测*** PD630在苯酚中生长时PheB1A1与PheB2A2的表达水平,发现它们的表达水平在生长的迟缓期和指数期均出现上调,并且PheB2A2的上调程度高于PheB1A1,表明PheB1A1与PheB2A2的表达均受苯酚的显著调控,且PheB2A2受苯酚的诱导程度更高。敲除PheB1A1与PheB2A2后*** PD630丧失了利用苯酚生长的能力,而在双敲除菌株中回补PheB1A1或PheB2A2都可恢复对利用的苯酚能力,表明PheB1A1与PheB2A2在*** PD630利用苯酚生长的过程中发挥着关键作用。此外,表达PheB1A1可使双敲除菌株在相对低表达水平的情况下更快地利用苯酚生长,表明PheB1A1与PheB2A2在催化苯酚的效率上存在差异。对PheB1A1与PheB2A2中PheA1与PheA2的氨基酸序列进行了生物信息学分析,二者的序列相似性为92.19%,系统发育分析结果显示它们与双组分苯酚羟化酶中单加氧酶的进化关系较近,保守序列分析结果显示它们都具有双组分黄素扩散单加氧酶(Two-component flavin-diffusible monooxygenase,TC-FDM)的保守序列,PheA1与PheA2三维结构的预测结果表明它们可能以同源四聚体形式存在,与苯酚的分子对接结果表明它们可能通过TC-FDM中的保守残基Arg-135、Tyr-139和His-177与苯酚发生相互作用。对PheA1和PheA2酶学性质的研究结果表明,其它来源的黄素还原酶(Ec Hpa C)可以使PheA1和PheA2发挥催化活性,PheA1的酶活性约为PheA2的2倍,二者均为双组分FAD依赖性单加氧酶,反应体系中适用的电子供体均为NADH,额外添加NAD会抑制它们的酶活性。二者的最适反应温度均为30℃,均在低温条件下稳定性较好、高温条件下较差,且PheA1的温度稳定性优于PheA2,此外,PheA1和PheA2还能催化4-香豆酸等木质素衍生酚类化合物。综上所述,本研究证实了PheB1A1与PheB2A2是*** PD630中的苯酚羟化酶基因簇,进一步解析了*** PD630降解苯酚的机制,丰富了对*** PD630降解木质素衍生芳香化合物机制的研究,为木质素衍生芳香化合物的降解和资源化利用提供了新的催化元件和理论基础。

关键词：浑浊红球菌PD630 苯酚羟化酶基因功能芳香化合物木质素

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苯酚羟化酶基因的研究进展

产业与科技论坛 2017年第14期16卷 48-50页

作者：苏佳岐张红兵河北经贸大学生物科学与工程学院

苯酚的生物降解受多组分的基因调控,其中编码苯酚羟化酶的基因为苯酚降解的关键基因。本文主要介绍了苯酚降解菌的高效筛选法,苯酚羟化酶基因的组成调控,以及苯酚降解菌的分类种属,同时介绍苯酚羟化酶基因的研究近况。

关键词：苯酚羟化酶生物降解组成调控

琼氏不动杆菌GXP04的苯酚羟化酶基因的克隆及序列分析

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广西农业生物科学 2006年第1期25卷 18-23页

作者：唐莉丽孙栋武波广西大学生命科学与技术学院微生物及植物遗传工程教育部重点实验室

提取琼氏不动杆菌GXP 04的总DNA,采用限制性内切酶E coRⅠ酶切处理后,构建以pLAFR 3为载体的基因组文库。通过TA IL-PCR扩增出苯酚羟化酶的上游基因,对菌落原位杂交获得的11个转化子进一步鉴定,最终确定其中的8个转化子含有完整的苯酚... 详细信息

提取琼氏不动杆菌GXP 04的总DNA,采用限制性内切酶E coRⅠ酶切处理后,构建以pLAFR 3为载体的基因组文库。通过TA IL-PCR扩增出苯酚羟化酶的上游基因,对菌落原位杂交获得的11个转化子进一步鉴定,最终确定其中的8个转化子含有完整的苯酚羟化酶基因,选取其中的pLAFR 3-7对GXP 04的苯酚羟化酶基因的核苷酸序列进行分析,并对其蛋白质基本性质进行预测。

关键词：琼氏不动杆菌GXP04 苯酚基因组文库苯酚羟化酶