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苯噻啶靶向Nrf2抑制食管鳞癌生长的机制研究

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苯噻啶靶向Nrf2抑制食管鳞癌生长的机制研究

作者：何鑫宇郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的食管癌(Esophagus cancer,EC)分为食管鳞癌和食管腺癌两种主要病理类型。据2020年统计,食管癌是全球癌症相关死亡的第六大病因。近三十年来食管癌治疗方面进展缓慢,目前食管癌晚期患者五年生存率仍不到20%。亟须在食管癌的防... 详细信息

背景和目的食管癌(Esophagus cancer,EC)分为食管鳞癌和食管腺癌两种主要病理类型。据2020年统计,食管癌是全球癌症相关死亡的第六大病因。近三十年来食管癌治疗方面进展缓慢,目前食管癌晚期患者五年生存率仍不到20%。亟须在食管癌的防治靶点及防治药物方面取得新的突破,从而提高患者的五年生存率。核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)由NFE2L2基因编码,是一种重要的转录因子,主要调控细胞抗氧化和应激反应。Nrf2在食管癌、胰腺癌、肺癌和乳腺癌中高表达,促进癌细胞增殖、转移及化疗耐药。近期研究表明Nrf2是致癌过程中的关键治疗靶点。Nrf2在食管鳞癌中过度活跃并诱导食管鳞状上皮角化,但是Nrf2在食管鳞癌中的作用机制需要进一步研究。最近的研究表明,小分子化合物Halofuginone、AEM1等在细胞水平上表现出Nrf2抑制活性,但是这些化合物是通过抑制蛋白质翻译从而降低Nrf2的蛋白水平,特异性较差。目前还没有Nrf2的抑制剂进入临床试验,发现具有临床价值的Nrf2抑制剂具有重要的意义。筛选临床非抗肿瘤药物来开展肿瘤的化学预防展示了广阔的前景。我们之前通过筛选临床药物库发现,线粒体氧化磷酸化抑制剂氯哌斯汀和过氧化物酶体抑制剂马来酸替加色罗可以抑制食管鳞癌的生长。因此通过对临床药物库进行筛选,可能是发现新的Nrf2抑制剂的一种有效、快速的方法。该课题研究了Nrf2在食管鳞癌中的表达水平,食管鳞癌中的功能,及其表达水平与临床预后的相关性。通过筛选临床药物库,发现苯噻啶能够靶向抑制Nrf2,在体内外水平探究苯噻啶对食管鳞癌生长的抑制作用,并通过蛋白质组学分析苯噻啶抑制食管鳞癌生长的分子机制。为阐明食管鳞癌的发生发展机制以及化学预防提出了新的策略。方法1.Nrf2在食管鳞癌中的表达水平分析和临床相关性分析:食管鳞癌组织芯片免疫组织化学染色,分析Nrf2在食管癌患者组织中的表达水平及其与患者预后、淋巴结转移的相关性。使用The Cancer Genome Atlas(TCGA)和GenotypeTissue Expression(GTEx)数据库分析Nrf2表达水平与食管癌患者临床相关性。2.Nrf2在食管鳞癌中的功能研究:使用CRISPR Cas9系统在食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450中敲除Nrf2,通过细胞生长实验、平板克隆实验和细胞系来源的异种移植(Cell line-derived xenotransplantation,CDX)模型验证敲除Nrf2对食管鳞癌增殖的影响。构建过表达Nrf2的KYSE30和KYSE510细胞系,通过细胞增殖实验、平板克隆实验评价Nrf2过表达后对食管鳞癌细胞增殖的影响。3.Nrf2抑制剂的筛选与验证:通过蛋白质-小分子的计算机模拟对接模型筛选出Nrf2靶向药物。采用蛋白下拉实验(Pull-down)、细胞热位移测定法(Cellular thermal shift assay,CETSA)、蛋白质分段表达纯化、Nrf2氨基酸位点突变验证靶向药物与Nrf2的结合。免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因和凝胶阻滞迁移电泳实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)评价药物对Nrf2功能的影响。4.苯噻啶对食管癌细胞增殖的影响:通过细胞毒性实验探究苯噻啶对永生化食管上皮细胞、食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450的细胞毒性作用;通过细胞生长实验研究苯噻啶对永生化食管上皮细胞系和食管鳞癌细胞系KYSE150、KYSE450增殖抑制作用;使用平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验评价苯噻啶对人食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450的锚定和非锚定依赖生长的影响。5.苯噻啶诱导食管鳞癌细胞铁死亡的研究:利用蛋白质组学分析苯噻啶处理后KYSE150细胞中的蛋白表达水平的变化,并结合生物信息学分析该化合物影响的下游信号通路,用免疫印迹法验证蛋白下调。使用活性氧检测、脂质过氧化检测、谷胱甘肽检测、铁死亡抑制剂挽救实验来验证铁死亡通路。6.苯噻啶对食管鳞癌生长的影响:通过食管鳞癌人源性组织异种移植瘤模型(Patient-derived xenografts,PDX)评价苯噻啶对食管鳞癌生长的抑制作用;通过免疫组织化学检测苯噻啶处理后移植瘤组织中Ki67和铁死亡相关蛋白(GPX4、ME1、GCLC、G6PD)的变化。7.苯噻啶对食管鳞癌复发的影响:通过建立食管鳞癌复发模型,评价苯噻啶对于食管癌复发的抑制作用。通过免疫组织化学检测苯噻啶处理后复发瘤组织中Ki67和铁死亡相关蛋白(GPX4、ME1、GCLC、G6PD)的变化。结果1.Nrf2在食管鳞癌中的表达水平分析和临床相关性分析:通过食管鳞癌组织芯片免疫组化染色评分,发现食管癌组织中Nrf2蛋白水平高于癌旁组织。分析食管

关键词：食管鳞癌苯噻啶核因子E2相关因子2 蛋白质组学铁死亡

苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

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苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

作者：郑江霞安徽医科大学

学位级别：硕士

目的观察不同浓度苯噻啶（Pizotifen）对人肺腺癌A549和PC9细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响,并初步探究其机制。方法传代培养人肺腺癌A549和PC9细胞,取对数生长期的细胞,将其分为对照组（细胞对照组为培养基直接作用于细胞、溶剂对照... 详细信息

目的观察不同浓度苯噻啶（Pizotifen）对人肺腺癌A549和PC9细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响,并初步探究其机制。方法传代培养人肺腺癌A549和PC9细胞,取对数生长期的细胞,将其分为对照组（细胞对照组为培养基直接作用于细胞、溶剂对照组为含有0.1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）的培养基作用于细胞）和实验组（浓度为10、20、30、40μmol/L的苯噻啶作用于细胞）。不同浓度苯噻啶作用24h和48h后采用CCK-8法检测人肺腺癌细胞的增殖能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用划痕实验和Transwell迁移实验检测人肺腺癌细胞的迁移能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用Transwell侵袭实验检测人肺腺癌细胞的侵袭能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用ELISA法检测人肺腺癌细胞中Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin,E-cad）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）的表达水平。比较并分析上述各实验指标的组间差异。结果各实验组检测指标与溶剂对照组相比:（1）CCK8法检测显示,实验组A549和PC9细胞活力降低,各组抑制细胞增殖的程度不一致;在相同作用时间（24h或48h）下,伴随苯噻啶浓度升高,实验组A549和PC9细胞活力越来越低,组间差异有统计学意义（24h（A549:F=210.7,P＜0.05;PC9:F=177.2,P＜0.05）和48 h（A549:F=132.3,P＜0.05;PC9:F=631.3,P＜0.05））;在相同作用浓度（20、30、40μmol/L）下,苯噻啶作用48h对细胞活力的抑制作用高于24h,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）划痕实验结果表明,苯噻啶作用24h后实验组划痕愈合率均低于溶剂对照组,苯噻啶浓度越高,划痕愈合率越低,差异具有统计学意义（A549:F=868.9,P＜0.05;PC9:F=921.0,P＜0.05）。（3）Transwell迁移实验结果显示,苯噻啶作用24h后实验组迁移至小室下的细胞数量均低于溶剂对照组,具有浓度依赖性,差异有统计学意义（A549:F=474.2,P＜0.05;PC9:F=784.6,P＜0.05）。（4）Transwell侵袭实验结果表明,苯噻啶作用24h后与溶剂对照组相比,实验组侵袭至小室下的肺腺癌细胞数量明显降低,具有浓度依赖性,差异有统计学意义（A549:F=354.0,P＜0.05;PC9:F=193.2,P＜0.05）。（5）ELISA结果显示,苯噻啶作用24h后与溶剂对照组相比,实验组细胞中Wnt3a（A549:F=534.62,P＜0.05;PC9:F=534.08,P＜0.05）、β-catenin（A549:F=124.51,P＜0.05;PC9:F=212.22,P＜0.05）和MMP-9（A549:F=215.96,P＜0.05;PC9:F=355.48,P＜0.05）蛋白浓度均显著降低,差异有统计学意义,且伴随苯噻啶浓度升高,Wnt3a、β-catenin和MMP-9蛋白浓度越来越低;作用24h后与溶剂对照组相比,实验组细胞中E-cad蛋白浓度大大增高,差异有统计学意义（A549:F=224.98,P＜0.05;PC9:F=534.08,P＜0.05）,伴随苯噻啶浓度升高,E-cad浓度也更高。结论在体外细胞实验中,苯噻啶对人肺腺癌A549和PC9细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用,抑制作用的强弱依赖于苯噻啶的浓度和作用时间,其作用机制可能是抑制Wnt3a/β-catenin-EMT通路。

关键词：苯噻啶人肺腺癌细胞增殖迁移侵袭

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苯噻啶与蛋白质作用特征的热力学研究

华中师范大学学报（自然科学版） 2002年第3期36卷 329-332页

作者：易长海颜承农上官云凤刘义潘祖亭屈松生湖北荆州师范学院化学系湖北荆州434020 武汉大学化学与分子科学学院武汉430072

用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法研究了在模拟人体生理条件下 ,苯噻啶与牛血清白蛋白 (BSA)结合反应的特征 ,发现苯噻啶对BSA有较强的荧光猝灭作用 ,且苯噻啶的紫外吸收光谱和BSA的荧光发射光谱有一定程度的重叠 ,由此得出了其结合... 详细信息

用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法研究了在模拟人体生理条件下 ,苯噻啶与牛血清白蛋白 (BSA)结合反应的特征 ,发现苯噻啶对BSA有较强的荧光猝灭作用 ,且苯噻啶的紫外吸收光谱和BSA的荧光发射光谱有一定程度的重叠 ,由此得出了其结合反应的结合常数、结合位置和结合过程的基本热力学参数 .

关键词：苯噻啶蛋白质热力学 BSA 荧光光谱法荧光猝灭作用牛血清白蛋白结合反应抗组胺药物

苯噻啶预防性治疗非洲混合性人群偏头痛前瞻性对照研究

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广东医学 2011年第8期32卷 1055-1056页

作者：马琦 Sabrina Marcellus-Maria 广东省人民医院广东省医学科学院老年医学研究所广州510080 塞舌尔维多利亚医院

目的观察苯噻啶对非洲混合性人群偏头痛的预防性治疗效果。方法临床诊断为偏头痛且成功随访的患者共50例随机分为苯噻啶组(1 mg,睡前服用)及阿米替林组(100 mg,睡前服用),分别于初诊时、服药1、2、3个月后采集临床信息资料并进行相关内... 详细信息

目的观察苯噻啶对非洲混合性人群偏头痛的预防性治疗效果。方法临床诊断为偏头痛且成功随访的患者共50例随机分为苯噻啶组(1 mg,睡前服用)及阿米替林组(100 mg,睡前服用),分别于初诊时、服药1、2、3个月后采集临床信息资料并进行相关内容评估。结果 3个月后,苯噻啶组中位发作频率由8次/月降低为1次/月,中位头痛持续时间由18 h/次减少为1 h/次,而中位自评头痛强度由7减少为1,均优于阿米替林组(P苯噻啶组为96.2%,阿米替林组为62.5%。结论对于非洲混合性人群偏头痛患者,苯噻啶对其发作频率、头痛持续时间及头痛强度的控制有较好疗效。

关键词：非洲混合性人群偏头痛苯噻啶阿米替林

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苯噻啶的荧光光谱分析法研究

化学试剂 2002年第2期24卷 88-89页

作者：颜承农余训民喻克雄潘祖亭刘义庆荆州师范学院化学系荆州434100 武汉大学化学与分子科学学院武汉430072

利用荧光光谱法研究了苯噻啶与浓硫酸反应产物的荧光光谱性质。

关键词：苯噻啶荧光光谱法药物分析抗乙酰胆碱药物

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紫花汤配合苯噻啶治疗红斑性肢痛症40例

中医杂志 2002年第10期43卷 766-767页

作者：刘庆宪王厹东浙江省平湖市中医院神经内科 314200 浙江省湖州市第三医院神经内科

本文以紫花汤佐苯噻啶治疗红斑性肢痛症40例,近远期效果较单纯西药为优。1 临床资料 1989年12月～2000年9月确诊为红斑性肢痛症的门诊及住院患者86例。其中治疗组40例,男16例,女24例,年龄15～67岁,平均40.25岁,全年均可发病,病程50～520... 详细信息

本文以紫花汤佐苯噻啶治疗红斑性肢痛症40例,近远期效果较单纯西药为优。1 临床资料 1989年12月～2000年9月确诊为红斑性肢痛症的门诊及住院患者86例。其中治疗组40例,男16例,女24例,年龄15～67岁,平均40.25岁,全年均可发病,病程50～520天,患者中31例在本法治疗前均曾接受过肠溶阿司匹林、地巴唑。

关键词：红斑性肢痛症中西医结合疗法紫花汤苯噻啶治疗

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高效液相色谱法测定人血浆中苯噻啶浓度

中国医院药学杂志 2007年第9期27卷 1317-1318页

作者：唐坤杨帆广西桂林医学院附属医院药剂科广西桂林541001 桂林医学院药学院

目的：测定人血浆中苯噻啶的浓度。方法：采用Sinochrom OPS—AP（4．6mm×250mm，5μm）色谱柱，检测波长为200nm，流动相为0．05mol·L^-1磷酸二氢钠缓冲液-乙腈-甲醇（50：41：9）（含1．5％三乙胺，磷酸调pH3．0）。流速为0．8mL·m... 详细信息

目的：测定人血浆中苯噻啶的浓度。方法：采用Sinochrom OPS—AP（4．6mm×250mm，5μm）色谱柱，检测波长为200nm，流动相为0．05mol·L^-1磷酸二氢钠缓冲液-乙腈-甲醇（50：41：9）（含1．5％三乙胺，磷酸调pH3．0）。流速为0．8mL·min^-1，以β-萘酚为内标。结果：苯噻啶在44．4～530．3μg·L^-1范围内呈良好线性关系（r=0．9995），提取回收率在75．3％～81．40A之间（RSD为1．6％～4．4％），日内和日间RSD分别为1．3％～6．5％和2．9％～9．5％。结论：该法操做简便、快速、准确、重复性好，适用于临床苯噻啶的药动学研究。

关键词：苯噻啶高效液相色谱法血药浓度

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高效液相色谱法测定苯噻啶的含量

中国现代应用药学 2003年第1期20卷 55-56页

作者：李纬王雪芹杨腊虎南京市药品检验所江苏南京210015 河南省药品检验所河南郑州450003 中国药品生物制品检定所北京100050

目的　建立苯噻啶含量测定的HPLC方法。方法　选用KromasilC18(2 5 0× 4.6mm ,5 μm)色谱柱 ,乙腈水三乙胺 (5 5∶45∶0 .2 )为流动相 ,检测波长 :2 5 6nm ,流速为 1.0mL·mL-1,进样量 2 0 μL。结果　苯噻啶在浓度为 6.5～ 2 0 8... 详细信息

目的　建立苯噻啶含量测定的HPLC方法。方法　选用KromasilC18(2 5 0× 4.6mm ,5 μm)色谱柱 ,乙腈水三乙胺 (5 5∶45∶0 .2 )为流动相 ,检测波长 :2 5 6nm ,流速为 1.0mL·mL-1,进样量 2 0 μL。结果　苯噻啶在浓度为 6.5～ 2 0 8μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。回归方程为A =64 185 .74+81992 .3×C ,r=0 .99998。结论　本法简便、灵敏、准确。

关键词：测定含量高效液相色谱法苯噻啶

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苯噻啶、心得安防治偏头痛的作用机制

神经损伤与功能重建 2008年第1期3卷 28-30页

作者：车雄宇杨晓苏胡益民谷峰魏杰张长应湖南省常德市第一中医院神经内科湖南常德415000 中南大学湘雅医院神经内科长沙410008

目的:探讨苯噻啶、心得安防治偏头痛的作用机制。方法:SD大鼠50只随机分为对照组、生理盐水(NS)组、模型组、苯噻啶组和心得安组。模型组、苯噻啶组和心得安组复制大鼠偏头痛模型,第2次造模后苯噻啶组和心得安组分别给予药物干预,第5次... 详细信息

目的:探讨苯噻啶、心得安防治偏头痛的作用机制。方法:SD大鼠50只随机分为对照组、生理盐水(NS)组、模型组、苯噻啶组和心得安组。模型组、苯噻啶组和心得安组复制大鼠偏头痛模型,第2次造模后苯噻啶组和心得安组分别给予药物干预,第5次造模后测定颈静脉血CGRP含量和脑干及三叉神经节α-CGRP mRNA的表达量,同时观察大鼠的行为学变化。结果:大鼠行为学观察显示,与模型组相比,苯噻啶组、心得安组对硝酸甘油的耐受性增强;各组间颈静脉血CGRP含量无显著性差异(P>0.05);③苯噻啶组、心得安组大鼠脑干及三叉神经节α-CGRP mRNA表达量明显低于其他组(P苯噻啶、心得安预防偏头痛发作可能与抑制脑干及三叉神经节α-CGRP mRNA表达有关。

关键词：苯噻啶心得安偏头痛降钙素基因相关肽