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利用新型红酵母苯丙氨酸解氨酶制备低苯丙氨酸酪蛋白

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生物技术通报 2024年

作者：张阿娜韩雪谷天一辛凤姣王钰璐山西农业大学食品学院中国农业科学院农产品加工研究所中国农业科学院农产品加工与营养健康研究院(沧州)

【目的】挖掘高活性、高稳定性的苯丙氨酸解氨酶（EC 4.***.1.24; penylalanine ammonia-lyase, PAL），为后续在制备无（低）苯丙氨酸特膳食品的应用奠定基础。【方法】从胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和双倒卵形红酵母（Rhodoto... 详细信息

【目的】挖掘高活性、高稳定性的苯丙氨酸解氨酶（EC 4.***.1.24; penylalanine ammonia-lyase, PAL），为后续在制备无（低）苯丙氨酸特膳食品的应用奠定基础。【方法】从胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和双倒卵形红酵母（Rhodotorula diobovata）中克隆到基因Rm PAL和Rd PAL，并通过生物信息学分析两个酶的序列和结构特征；在大肠杆菌中异源表达纯化Rm PAL和Rd PAL蛋白，测定最适反应条件和底物特异性；通过高效液相色谱和苯丙氨酸试剂盒测定了Rm PAL和Rd PAL转化酸解酪蛋白（casein acid hydrolysate, CAH）中苯丙氨酸（L-phenylalanine, L-Phe）的能力。【结果】Rm PAL和Rd PAL是真菌来源的PAL，分别由3个结构域组成：MIO结构域（MIO domain）、核心结构域（core domain）和屏蔽结构域（shielding domain），活性中心具有催化氨基酸Tyr和底物特异性特征氨基酸His;Rm PAL和Rd PAL在溶液中均以四聚体形式存在，两个酶的最适pH和最适温度均为8.9和50℃，且具有较宽泛的pH和温度稳定性，优于黏红酵母来源的商用PAL酶；此外，两种酶均能催化L-Phe和酪氨酸（L-tyrosine, L-Tyr）反应，且对L-Phe的催化效率较高，约为L-Tyr的5倍，脱除酸解酪蛋白中L-Phe的转化率分别为88%和93%。【结论】Rm PAL和Rd PAL具有较强稳定性和L-Phe水解偏好性，可从食源蛋白中有效去除L-Phe。

关键词：苯丙酮尿症苯丙氨酸解氨酶低L-Phe蛋白催化活性热稳定性 L-Phe转化率特医食品

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白芷中苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及功能验证

分子植物育种 2024年

作者：周俊余晗张晶贺欣怡袁磊彭思晴何岳东钟晓红湖南农业大学生物科学技术学院湖南农业大学园艺学院

本研究首次成功从白芷中克隆并验证了4条苯丙烷类途径的起始关键酶—苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase， PAL)。通过生物信息学分析、体外验证、酶学性质、酶动力学和分子对接方法分析AdPAL1-4基因。结果表明AdPAL1-4基因序... 详细信息

本研究首次成功从白芷中克隆并验证了4条苯丙烷类途径的起始关键酶—苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase， PAL)。通过生物信息学分析、体外验证、酶学性质、酶动力学和分子对接方法分析AdPAL1-4基因。结果表明AdPAL1-4基因序列具有活性结构区域位点“ASG”三联体且均能催化L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine， L-Phe)生成反式肉桂酸(t-Cinnamic acid)；酶学性质表明，最适反应温度40℃，最适反应pH 8.0，酶动力学结显示，AdPAL2催化效率最高(Kcat/Km=3196.6)；对接结果显示，底物小分子与Glu480和Asn483之间有氢键作用力，活性口袋附近分布多个疏水氨基酸，包括Phe110、Gly200、Leu202、Asn256和Gln484等，这些位点可能是调控催化活性的关键氨基酸位点。该研究为白芷中香豆素类化合物的合成生物学研究提供良好的工具酶，具有潜在的应用前景。

关键词：白芷苯丙氨酸解氨酶基因克隆酶学性质香豆素化合物

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苯丙氨酸解氨酶基因密码子偏好性与进化分析

生物学杂志 2022年第3期39卷 36-40页

作者：李秋娥秦余郑乔木谭国栋廖海周嘉裕西南交通大学生命科学与工程学院成都610031

利用Codon W与EMBOSS等程序,分析42种不同植物来源的PAL基因序列密码子偏好性及可能形成机制,旨在为植物PAL基因的表达提高提供理论指导。RSCU结果显示,相比其他植物单子叶植物的密码子偏好性较高,CUC是其最优密码子。单子叶等植物偏好... 详细信息

利用Codon W与EMBOSS等程序,分析42种不同植物来源的PAL基因序列密码子偏好性及可能形成机制,旨在为植物PAL基因的表达提高提供理论指导。RSCU结果显示,相比其他植物单子叶植物的密码子偏好性较高,CUC是其最优密码子。单子叶等植物偏好以G/C编码,双子叶植物偏好以A/T编码。ENc-plot结果表明,双子叶植物的偏好性主要受自然选择的影响,而单子叶植物的偏好性受到突变与自然选择的双重影响。聚类分析表明,基于CDS序列的聚类比基于RSCU聚类更适合作为植物系统发育分析。绝大多数单子叶植物适合在大肠杆菌中表达,而双子叶植物的PAL基因适合在酵母中表达;拟南芥相比烟草更适合作为所有42种植物PAL基因的遗传转化宿主。研究结果可为植物PAL基因的遗传进化研究与功能验证等奠定理论基础。

关键词：贝母苯丙氨酸解氨酶密码子偏好性进化分析

云锦杜鹃苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及功能分析

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生物工程学报 2022年第1期38卷 374-385页

作者：吕思佳吴月燕贾永红何凡蒋宝鑫杨国霞谢晓鸿浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315100

苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase,PAL)是植物香气化合物中苯甲酸甲酯合成途径的关键酶。为探究云锦杜鹃Rhododendron fortunei RhPAL基因的功能,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆RhPAL基因全长cDNA序列,并应用高效液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)联用技术分析云锦杜鹃不同发育阶段的不同组织中RhPAL基因表达水平和代谢物含量变化关系。结果表明,从云锦杜鹃花cDNA中克隆得到RhPAL基因,含有完整的cDNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列长2145bp,编码715个氨基酸,与其他物种的PAL蛋白质氨基酸序列具有较高的同源性;qRT-PCR分析表明,在不同花期的花瓣中,RhPAL表达量呈上升趋势,在衰败期表达量最高,雌蕊的表达量远远高于雄蕊,同时,新叶高于老叶,叶片的表达量高于花瓣和花蕊。通过酶联检疫法检测分析云锦杜鹃不同花期的花瓣中PAL酶活性,在花苞期酶活性最高,衰败期最低,总体呈下降趋势。通过LC-MS技术,检测分析云锦杜鹃中苯丙氨酸(phenylalanine,L-Phe)和肉桂酸(cinnamic acid,Ca)的含量,发现在云锦杜鹃不同组织中苯丙氨酸和肉桂酸的含量变化趋势与RhPAL基因表达水平相一致,且均与RhPAL基因表达量呈高度相关。推测RhPAL在云锦杜鹃花香物质合成中发挥关键作用,本研究结果可为研究杜鹃花香气物质分子调控机制提供理论依据。

关键词：杜鹃高效液相色谱-质谱联用苯丙氨酸解氨酶基因克隆生物信息学分析肉桂酸

半理性设计提高Anabaena variabilis来源的苯丙氨酸解氨酶的催化活性

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药学学报 2022年第12期57卷 3669-3674页

作者：魏西羽冯翠月吕瑞杰樊帅杨兆勇张志斐华北理工大学药学院河北唐山063200 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)可催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸,广泛应用在制药、食品和农业等领域中,尤其来源于多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL (AvPAL)是现有唯一治疗苯丙酮尿症的蛋白类药物。但较低的活... 详细信息

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)可催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸,广泛应用在制药、食品和农业等领域中,尤其来源于多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的PAL (AvPAL)是现有唯一治疗苯丙酮尿症的蛋白类药物。但较低的活性和较差的稳定性限制了PAL在工业中广泛的应用。本研究针对组成AvPAL底物结合腔的氨基酸,通过点饱和突变文库筛选获得了活性提高的突变体,并通过定点突变探讨了M222位点对活性的影响。研究发现突变体M222L和M222V的k_(cat)值相比于AvPAL提高90%和60%,同时k_(cat)/K_(m)较AvPAL提高至1.4和1.5倍。结合分子对接结果显示,突变体M222L和M222V通过增加底物结合腔的疏水性提高AvPAL的催化活性。本研究对于阐明AvPAL关键底物结合位点结构与活性的关系具有重要的意义。

关键词：苯丙氨酸解氨酶饱和突变催化效率分子对接

桃儿七苯丙氨酸解氨酶的基因克隆及其酶活分析

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生物工程学报 2023年第7期39卷 2818-2838页

作者：胡迪罗晓伟王宇贤龚明邹竹荣云南师范大学生命科学学院教育部生物质能源持续发展和应用工程研究中心云南昆明650500

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)作为植物苯丙烷类途径的入口关键酶,对抗肿瘤木脂素——鬼臼毒素的生物合成具有重要影响。桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]是鬼臼毒素的主要天然来源,以四川阿坝地区桃... 详细信息

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)作为植物苯丙烷类途径的入口关键酶,对抗肿瘤木脂素——鬼臼毒素的生物合成具有重要影响。桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]是鬼臼毒素的主要天然来源,以四川阿坝地区桃儿七植株的根为材料,基于桃儿七公共SRA转录组数据包,通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆其苯丙氨酸解氨酶基因ShPAL。生物信息学分析表明,ShPAL编码蛋白由711个氨基酸组成,包含PAL保守结构域,有芳香族氨基酸解氨酶活性中心的特征性基序,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,单体三级结构呈现典型的“海马状”,Swiss建模空间结构为同源四聚体,在系统发育谱系上与同属小蘖科(Berberidaceae)的三枝九叶草(Epimedium sagittatum)PAL序列相似度最高、进化距离最短。亚细胞定位实验结果显示ShPAL蛋白主要定位于细胞质中、少量定位于内质网膜上。ShPAL蛋白通过大肠杆菌(Escherichia coli)重组表达和组氨酸标签亲和纯化,其酶活高达20.91 U/mg,最适温度为41℃,最适pH为9.0;其F130H突变体酶活降低约23.6%,但随温度、pH变化的趋势不变,证实该位置的苯丙氨酸确为影响PAL底物特异性的残基;两者的热稳定性均较差,但pH稳定性较好。这些结果将有助于进一步分析ShPAL在鬼臼毒素生物合成过程中的调控作用,以及促进鬼臼毒素异源合成,从而保护桃儿七种质资源,同时也表明ShPAL可在生物化工和生物医学方面具有潜在应用价值。

关键词：桃儿七苯丙氨酸解氨酶基因克隆生物信息学分析酶活分析

苯丙氨酸解氨酶介导植物对病原菌和害虫的广谱抗性

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Science Bulletin 2020年第17期65卷 1425-1427页

作者：尤小满方红王如意王国梁宁约瑟 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests Institute of Plant ProtectionChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100193China Lingnan Guangdong Laboratory of Modern Agriculture Genome Analysis Laboratory of the Ministry of AgricultureAgricultural Genomics Institute at ShenzhenChinese Academy of Agricultural SciencesShenzhen 518124China Department of Plant Pathology The Ohio State UniversityColumbusOH 43210USA

Phenylalanine ammonia lyases(PALs)are pivotal enzymes for the biosynthesis of lignin,salicylic acid(SA),and other phenylalanine-derived metabolites.Although the functions of PAL genes in plant defense have been studied for over two decades[1],how these genes regulate plant immunity remains obscure.Rice blast(caused by the fungal pathogen Magnaporthe oryzae),bacterial blight(caused by the bacterial pathogen Xanthomonas oryzae pv oryzae or Xoo),and the insect pest brown planthopper(BPH)(Nilaparvata lugens Stål,Hemiptera,Delphacidae)are the most serious threats to global rice production and food security[2,3].

关键词：苯丙氨酸解氨酶广谱抗性 blight

苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用

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应用生态学报 2015年第7期26卷 2041-2049页

作者：董春娟李亮曹宁尚庆茂张志刚中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室北京100081

为了探讨苯丙氨酸解氨酶(PAL)在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用,采用喷施特异抑制剂(AOPP)的方法控制PAL活性,测定幼苗抗寒性的变化.结果表明:低温可以诱导黄瓜幼苗叶片中PAL的基因表达和活性升高;喷施AOPP显著抑制了叶片中PAL活性,减少了... 详细信息

为了探讨苯丙氨酸解氨酶(PAL)在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用,采用喷施特异抑制剂(AOPP)的方法控制PAL活性,测定幼苗抗寒性的变化.结果表明:低温可以诱导黄瓜幼苗叶片中PAL的基因表达和活性升高;喷施AOPP显著抑制了叶片中PAL活性,减少了酚类和类黄酮物质的积累.低温对黄瓜幼苗造成显著伤害,AOPP预处理加剧了低温对幼苗的损伤,幼苗抗寒性降低.与对照相比,幼苗叶片中相对电解质渗漏率和丙二醛(MDA)含量显著升高,PSII最大光化学效率(Fv/Fm)降低,光化学猝灭参数Y(NO)升高,胁迫相关基因(PR1-1a、COR47、P5CS、HSP70)的诱导表达受到抑制.低温导致黄瓜幼苗叶片中H2O2积累,还原型抗坏血酸(As A)含量降低,脱氢抗坏血酸(DHA)含量升高,As A∶DHA减小;喷施AOPP的幼苗中抗氧化酶(过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX)活性显著低于对照,H2O2过量积累,As A∶DHA更低.施用H2O2清除剂可以有效缓解喷施AOPP引起的低温损伤加剧,而施用CAT抑制剂的幼苗对低温胁迫更敏感.表明低温诱导了PAL活性升高,促进了苯丙烷类次生代谢产物的合成,提高了胞内抗氧化酶活性,可有效清除活性氧分子,维持As A氧化还原状态,缓解低温引起的光损伤和氧化损伤.

关键词：黄瓜苯丙氨酸解氨酶抑制剂低温胁迫抗性

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苯丙氨酸解氨酶生物传感器线性化的研究

哈尔滨工业大学学报 2005年第8期37卷 1085-1086,1112页

作者：周真贺长水哈尔滨理工大学测控技术及通讯工程学院黑龙江哈尔滨150040

针对苯丙氨酸解氨酶的新型酶生物传感器非线性特性,依据最小二乘法理论,采用最优化技术,建立了标定最佳拟合直线的数学模型,编写了数据拟合程序,实际运行结果表明,该方法克服了生物传感器校正传统方法拟合准确度低的缺点.

关键词：生物传感器苯丙氨酸解氨酶线性化最佳拟合直线