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安徽农业科学 2018年第1期46卷 1-4,23页

作者：杨光罗建平王瑛合肥工业大学食品科学与工程学院安徽合肥230009 河北大学生命科学学院河北保定071002

[目的]研究外源多胺促进霍山石斛类原球茎芽的发生与过氧化氢(H_2O_2)代谢酶活性的关系。[方法]主要测定了外源多胺处理后H_2O_2的动态变化和代谢酶的活性。[结果]外源多胺在有效促进芽发生的同时也能显著提高培养物中H_2O_2的含量,2.0 ... 详细信息

[目的]研究外源多胺促进霍山石斛类原球茎芽的发生与过氧化氢(H_2O_2)代谢酶活性的关系。[方法]主要测定了外源多胺处理后H_2O_2的动态变化和代谢酶的活性。[结果]外源多胺在有效促进芽发生的同时也能显著提高培养物中H_2O_2的含量,2.0 mmol/L亚精胺(Spd)或腐胺(Put)处理5 d的培养物中H_2O_2含量分别比对照组高175.6%和180.6%,添加H_2O_2淬灭剂二甲基硫脲(DMTU)可抑制类原球茎芽的发生,补充Spd或Put可部分解除DMTU的抑制作用。在外源多胺处理前期和中期,虽然超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性无明显改变,但合成H_2O_2的多胺氧化酶(PAO)活性和分解H_2O_2的抗坏血酸过氧化物酶(APX)与过氧化氢酶(CAT)活性明显增加。[结论]外源多胺作用的霍山石斛类原球茎芽的发生与H_2O_2积累和分解代谢有关。

关键词：霍山石斛外源多胺类原球茎芽发生代谢酶

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FmESR1在水曲柳下胚轴芽再生中的功能研究

FmESR1在水曲柳下胚轴芽再生中的功能研究

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作者：纪欣童东北林业大学

学位级别：硕士

本研究针对水曲柳组培微繁瓶颈,从再生关键基因入手,以水曲柳下胚轴为实验材料,筛选出下胚轴芽再生关键基因FmESR1,进行基因编码序列及启动子克隆、生物信息学分析,将启动子调控元件与再生相关因素联系起来,共同分析FmESR1基因的功能;... 详细信息

本研究针对水曲柳组培微繁瓶颈,从再生关键基因入手,以水曲柳下胚轴为实验材料,筛选出下胚轴芽再生关键基因FmESR1,进行基因编码序列及启动子克隆、生物信息学分析,将启动子调控元件与再生相关因素联系起来,共同分析FmESR1基因的功能;进一步构建pROK Ⅱ-FmESR1-GUS过表达载体,对水曲柳下胚轴进行稳定转化,获得FmESR1过表达转基因植株,结合水曲柳下胚轴芽再生过程中不定芽发育性状、生理指标及再生相关基因表达量的变化来解析FmESR1对芽再生的作用。主要内容如下:1.不定芽分化过程的芽再生相关基因表达特征和关键基因的筛选:水曲柳下胚轴芽再生过程中,下胚轴的形态及颜色等外部状态随着培养时间的延长而变化,在培养至12d出现明显的芽点凸起,随后芽点的数量随培养时间的增多而增多至一定程度时,再生芽随着培养时间而不断伸长。在芽点形成的早期,6～12d,芽再生相关基因WUS、WIND1、ARR1、ARR2、ARR12、WOX5、ESR1、CUC1、YUC、AHP、REV 的表达量均上升,说明这些基因可能参与芽点的形成并起到积极的调控作用。芽伸长时期,12～36d,PHV、WOX4、CUC1、YUC、REV、AHP基因表达量升高,说明这些基因可能会促进芽的伸长。***1基因与启动子克隆及激素信号诱导表达分析:克隆得到水曲柳ESR1基因,并命名为FmESR1基因。生物信息学分析其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列,FmESR1基因长度为972bp,编码323个氨基酸。FmESR1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,等电点为7.62,在151～339位置有一个AP2保守结构域。构建FmESR1蛋白系统进化树,发现FmESR1蛋白与野生橄榄ESR1蛋白序列相似度较高。亚细胞定位结果显示,FmESR1定位于细胞核。通过荧光定量PCR分析,FmESR1基因响应6-BA、ABA、GA3、BR、IAA、TDZ六种再生关键激素信号的刺激。克隆得到FmESR1基因上游启动子全长为1977bp。FmESR1基因的启动子含有细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、生长素、MeJA、光响应及种子发育等调控元件,这和上述FmESR1基因对激素的应答表达结果相吻合,说明FmESR1基因可能在芽再生过程中通过响应激素的诱导调控不定芽的发生。3.瞬时过表达FmESR1对水曲柳再生相关基因表达的影响:构建pROK Ⅱ-FmESR1-GUS过表达载体并转化到农杆菌中,瞬时侵染水曲柳种子萌发苗,发现B型ARRs表达量升高,ESR1基因下游CUC1基因表达量也升高,且FmESR1基因与ARR1、ARR12、CUC1表达具有相关性,协同对不定芽的分化一起发挥作用。***1在水曲柳下胚轴不定芽发育过程中的功能分析:下胚轴芽再生过程来看,转基因下胚轴在不定芽诱导9d出现芽点,空载对照组在第12d才开始出现芽点,转基因下胚轴出芽时间早于对照组3～5d;转基因下胚轴不定芽分化率达到81.2%较空载对照组（46.8%）升高了 34.4%,说明FmESR1基因对芽点分化有促进作用;转基因下胚轴不定芽数量为对照组的2倍且再生芽为丛生芽状态,且生长势和生长速度好于空载对照。根据生理指标的结果,我们推测FmESR1过表达下胚轴可能由于基因表达量升高,导致不定芽分化能力增强,进而引起各种生理指标的变化。石蜡切片结果发现,水曲柳下胚轴在5～7层皮层细胞形成不定芽的特殊细胞结构。***1转基因水曲柳中的再生关键基因表达分析:检测分化培养15d的稳定过表达FmESR1下胚轴的芽再生相关基因表达情况,发现过表达FmESR1促进了 1 1种芽再生相关基因表达量不同程度的升高,其中芽再生关键基因WIND1、WUS、CUC1基因表达量显著升高,分别为空载对照的4.95、3.77、3.32倍。这些基因的表达量的变化说明FmESR1基因可能通过促进芽再生相关基因表达,共同参与了不定芽分化发育进程的调控,但不同基因对不定芽分化的作用可能有差异。

关键词：水曲柳下胚轴芽发生 FmESR1基因基因表达基因功能

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细胞分裂素和生长素调控杨树分生组织活动的机理研究

细胞分裂素和生长素调控杨树分生组织活动的机理研究

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作者：王燕山东农业大学

学位级别：硕士

茎端分生组织(Shoot apical meristem, SAM)的离体发生是植物基因工程的先决条件,维管形成层的活动是植物次生生长和木材形成的基础。研究表明细胞分裂素在离体芽发生和形成层活动过程中均发挥了至关重要的作用,然而在木本植物中,其调... 详细信息

茎端分生组织(Shoot apical meristem, SAM)的离体发生是植物基因工程的先决条件,维管形成层的活动是植物次生生长和木材形成的基础。研究表明细胞分裂素在离体芽发生和形成层活动过程中均发挥了至关重要的作用,然而在木本植物中,其调控机制目前尚不清楚。本研究以84K杨为材料,建立了一套稳定的农杆菌介导的遗传转化体系。利用人工合成的生长素响应启动子DR5驱动GUS报告基因对离体芽发生过程中生长素响应信号的分布模式进行了分析。结果表明,离体芽诱导初期,生长素响应信号在愈伤组织的边缘均匀分布,并随着诱导时间的延长逐渐开始区域化分布;茎端分生组织开始形成时,DR5::GUS信号集中在茎端分生组织的上部两侧;茎端分生组织形成后,GUS信号特异分布在L1层细胞中。原位杂交结果显示,编码杨树细胞分裂素B类反应调节因子的RR12和RRl3基因的表达信号在离体芽诱导初期在愈伤组织的边缘均匀分布,随后呈现出区域化集中的分布模式,最终在除L1层细胞以外的整个茎端分生组织中均有分布。上述时空分布模式与拟南芥中的情况是一致的,表明生长素和细胞分裂素在调控杨树和拟南芥离体芽发生过程中所起的作用是相似的。利用artifical microRNA手段同时下调这两个基因的表达获得了一系列amiR-RR12,13转基因株系。选取转基因植株叶片进行离体芽诱导,结果发现与野生型相比,RR12和RR13的表达量下调后,导致离体芽发生频率和每块外植体上形成离体芽的数目均明显降低,表明RR12和RR13参与了杨树离体芽的发生过程。进一步的分析发现,RR12和RR13在维管形成层区域有较强的表达信号。下调RRl2和RR13的表达量造成杨树植株生长受到抑制。统计结果表明,amiR-RR12,13转基因植株茎第20节的直径明显小于野生型对照。细胞学分析发现,与野生型相比,amiR-RR12,13转基因植株茎的次生木质部和次生韧皮部比例降低、次生生长受到了抑制。qRT-PCR结果显示RR12和RR13在amiR-RR12,13转基因植株茎中的转录水平明显降低,而其他B类RRs未表现出明显变化,表明上述表型是特异降低RR12和RR13转录水平的结果。这些结果说明RR12和RR13通过维持维管形成层的正常活动参与了对次生生长过程的调控。本研究的结果表明,细胞分裂素通过其下游信号转导途径中的RR12和RR13介导了离体芽的发生和维管形成层的活动,并在上述过程中发挥了正向调控作用。

关键词：杨树芽发生生长素细胞分裂素细胞分裂素反应调节因子形成层

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