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拟南芥TRAPPⅡ复合体亚基Trs120及Trs130在花粉管生长中的功能研究

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拟南芥TRAPPⅡ复合体亚基Trs120及Trs130在花粉管生长中的功能研究

作者：佟玥姗南京农业大学

学位级别：硕士

雄配子体（花粉）发育是高等植物有性生殖的关键步骤之一,它是一个受到精确调控的复杂过程,分为小孢子发生、雄配子体发生、花粉管萌发和生长三个阶段。囊泡运输作为植物细胞内物质运输的主要形式,在其中发挥关键作用。在真核生物细胞... 详细信息

雄配子体（花粉）发育是高等植物有性生殖的关键步骤之一,它是一个受到精确调控的复杂过程,分为小孢子发生、雄配子体发生、花粉管萌发和生长三个阶段。囊泡运输作为植物细胞内物质运输的主要形式,在其中发挥关键作用。在真核生物细胞的内膜系统中,细胞器之间主要依赖囊泡运输完成物质传递。囊泡运输可以分为出芽、转运、拴系以及融合四个基本步骤。拴系过程是在拴系因子介导下发生的囊泡与靶膜之间特异性识别的过程。TRAPPⅡ复合体（Transport Protein Particle Ⅱ）是位于TGN（trans-Golgi Network）的多亚基拴系复合体。已有研究发现TRAPPⅡ复合体包含两个特异的亚基,Trs120和Trs130。在拟南芥中,Trs120介导的胞外分泌过程在植物芽和根中的维管发育和细胞生长中起着重要作用。在拟南芥根尖中,Trs120和Trs130参与调节细胞板组装过程,为细胞板形成所必需。但是,TRAPPⅡ复合体在花粉管生长中的功能尚不清楚。本论文研究了拟南芥Trs120和Trs130在花粉管顶端生长中的功能。1.Trs120和Trs130基因在花粉管极性生长过程中发挥重要作用通过进化树和Real-time PCR结果分析发现,Trs120和Trs130基因进化保守且在花粉中表达较高,暗示二者在花粉发育过程中发挥作用。对trs120/+和trs130/+突变体的鉴定和遗传分析发现,这两个突变体的雄配子体传递率明显下降。通过扫描电镜（SEM）、亚历山大染色和DAPI染色的方法分别观察trs120/+和trs130/+突变体花粉粒的形态、活性以及核分裂情况,发现花粉粒的发育未受到影响,说明突变花粉粒的形成正常。进一步体外萌发实验表明trs120/+和trs130/+突变体的花粉粒萌发正常,但粗短花粉管的比例明显高于野生型。因此,Trs120和Trs130的突变导致花粉管的极性生长缺陷,从而降低了雄配子体的传递效率。2.Trs120和Trs130参与花粉管部分外泌途径我们分别用JIM5和JIM7抗体观察trs130和trs120突变花粉管中去甲酯化和高度甲酯化的果胶的分布情况,结果表明这些果胶的分布情况与野生型相似。G-CaMP5能够显示花粉管中Ca2+的浓度。G-CaMP5的表达情况表明trs130和trs120花粉管中Ca2+的分布无异常。在trs130花粉管中,GFP-CSLD1保留了高尔基体的定位,但是在花粉管顶端PM的定位大大减少。花粉特异性表达的Syntaxin家族成员SYP124的定位相比野生型在花粉管顶端明显增加。这些结果说明Trs120和Trs130参与花粉管部分物质的极性外泌过程。

关键词：拟南芥花粉管生长 TRAPPⅡ复合体 Trs120 Trs130

一氧化氮调节茶树花粉低温萌发和花粉管生长的研究

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一氧化氮调节茶树花粉低温萌发和花粉管生长的研究

作者：李孝诚南京农业大学

学位级别：硕士

茶树花粉的萌发受到多种因素的影响,相关报道表明植物生长调节剂以及微量元素等均可以影响茶树离体花粉的萌发和花粉管的生长。此外低温影响花粉萌发已经在多种植物上报道。本研究在前人的研究基础上,应用不同的一氧化氮(NO)试剂及cGMP... 详细信息

茶树花粉的萌发受到多种因素的影响,相关报道表明植物生长调节剂以及微量元素等均可以影响茶树离体花粉的萌发和花粉管的生长。此外低温影响花粉萌发已经在多种植物上报道。本研究在前人的研究基础上,应用不同的一氧化氮(NO)试剂及cGMP试剂调节低温下茶树花粉的萌发和花粉管生长,以探讨低温下一氧化氮(NO)调控茶树花粉萌发和花粉管生长的有效途径.主要结果如下：新鲜花粉在低温(4℃)和常温(25℃)下培养3小时结果表明低温处理可以明显的抑制花粉萌发率和花粉管的生长。常温下用不同浓度的外源NO供体SNP(0,50,100,200,1000μmol/L)和DEA NONOate (0,25,50,75,100μmol/L)处理的花粉,结果表明施加SNP和DEA NONOate处理均能抑制花粉的萌发和花粉管的生长并且随着SNP和DEA NONOate浓度的加大,抑制作用加强。NOS抑制剂L-NNA以及NO清除剂cPTIO处理,可减弱SNP和DEA NONOate处理对花粉萌发率和花粉管生长的抑制作用。低温下, SNP和DEA NONOate可促进低温胁迫对花粉萌发和花粉管生长的抑制作用;L-NNA和cPTIO处理,可减弱低温胁迫对花粉萌发和花粉管生长的抑制作用。运用激光共聚焦显微镜技术以及血红蛋白法研究低温下花粉管内部NO分布及含量的变化。结果表明,与常温相比,低温提高花粉管内NO含量。常温和低温下,L-NNA和cPTIO处理均可以抑制花粉管内NO含量的上升以及在花粉管内的分布;SNP, DEA NO NOate则具有相反的作用。运用血红蛋白法测定NOS活性在低温下有明显提高(P花粉管内cGMP含量的升高,Viagra抑制磷酸二酯酶(PDEs),促进cGMP含量的上升。结果表明：培养液中添加80μMViagra可以促进低温对花粉的萌发率和花粉生长的抑制作用,而培养液中添加50μM/L ODQ可以减弱低温对花粉的萌发率和花粉管生长的抑制作用。在低温条件下,ODQ与SNP或DEA NONOate共培养的花粉萌发率和花粉管长度均比单独添加SNP或DEA NONOate的结果要高。在低温条件下,Viagra与cPTIO或L-NNA共培养的花粉萌发率和花粉管长度均比单独添加cPTIO或L-NNA的结果要低。运用高效液相色谱可以看出,低温导致花粉中cGMP含量上升,并且NO的释放剂(DEA NONOate)也能促使花粉中cGMP的上升,而NOS的抑制剂(L-NNA)具有相反的作用。以上结果表明cGMP信号分子的参与,至少是部分参与,低温和NO对花粉的萌发和花粉的生长的抑制作用。茚三酮法测定花粉中脯氨酸的结果表明：低温和外源NO释放剂(SNP,DEA NONOate)可以提高花粉管内脯氨酸的含量,而添加L-NNA或cPTIO培养的花粉中脯氨酸的含量下降。进一步结合ODQ和Viagra处理后发现,ODQ处理降低花粉中脯氨酸含量并且逆转了低温及SNP和DEA NONOate诱导的脯氨酸含量上升效应,Viagra处理促进了花粉中脯氨酸的上升并且减弱了低温下cPTIO或L-NNA对花粉内脯氨酸的降低作用。本实验表明低温下茶树花粉中NO和cGMP信号分子均升高,参与低温对花粉萌发和花粉管生长的抑制过程,并促进花粉中脯氨酸含量的升高。

关键词：低温花粉萌发率花粉管生长 NO cGMP 脯氨酸

拟南芥COG4与Glo3P型ArfGAP蛋白的互作及其在花粉管生长中的功能研究

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拟南芥COG4与Glo3P型ArfGAP蛋白的互作及其在花粉管生长中的功能...

作者：魏娟南京农业大学

学位级别：硕士

囊泡运输是真核生物细胞内物质运输的一种重要形式,它可以分为囊泡形成、转运、拴系和融合四个步骤。拴系是囊泡与靶膜初步接触并识别的过程,主要由拴系因子来介导。COG复合体（Conserved Oligomeric Golgi complex）是位于高尔基体上... 详细信息

囊泡运输是真核生物细胞内物质运输的一种重要形式,它可以分为囊泡形成、转运、拴系和融合四个步骤。拴系是囊泡与靶膜初步接触并识别的过程,主要由拴系因子来介导。COG复合体（Conserved Oligomeric Golgi complex）是位于高尔基体上的多亚基拴系复合体。在拟南芥中,COG3和COG8亚基在高尔基体形态维持以及花粉管的极性生长中发挥作用。本文对拟南芥COG4与Glo3P型ArfGAP蛋白互作以及在花粉管生长过程中的作用进行了研究,主要结果如下:1.COG4基因的表达和COG4蛋白的定位RT-PCR和GUS染色分析表明COG4基因在花粉中高表达;在烟草表皮细胞中COG4-GFP定位在高尔基体上。2.COG4基因突变导致花粉管生长缺陷cog4/+突变体的遗传分析表明,其雄配子体不育,同时雌配子体遗传信息的传递效率也明显下降。将COG4的全长基因转入cog4/+突变体中,能回补其雄配子体不育,雌配子体半不育的表型,说明cog4/+突变体配子体发育异常是由COG4基因突变所导致。通过扫描电镜（SEM）、亚历山大染色以及DAPI染色的方法观察cog4/+突变体花粉粒外壁的形态、花粉活性以及花粉的核分裂情况,与野生型相比没有显著差异,说明cog4/+花粉的发育正常。cog4/+突变花粉体外萌发正常,但在花粉管生长过程中,60%花粉管呈现出畸形以及爆裂表型。因此,cog4/+突变体的雄配子体不育是由花粉管生长缺陷所导致。3.COG4基因突变导致高尔基体形态异常我们通过荧光观察发现,在野生型花粉中EMP12-GFP标记的高尔基体呈棒状结构,其中有86%花粉的高尔基体长宽比为2.0-3.5,而cog4/+突变花粉中的该比例为18%,这说明在突变花粉中,高尔基体形态结构发生了改变。高压冷冻固定-冷冻替换处理的样品经透射电镜观察发现,在cog4/+突变花粉中高尔基体潴泡（Golgi cisternea）宽度变短,每个潴泡之间的距离变大,高尔基体潴泡失去cis-trans极性。COG4基因突变导致高尔基体形态结构异常。cog4/+突变花粉中COPI囊泡包被蛋白γ-COP-GFP和Arf1家族小G蛋白Arf1c-GFP定位受到影响,弥散在细胞质中。4.拟南芥COG4蛋白与Glo3P型ArfGAP互作为了进一步探究COG4基因的功能,我们以COG4蛋白为诱饵筛选拟南芥酵母双杂交DNA文库,得到了一个互作蛋白AGD8（ArfGAP domain 8）。拟南芥中AGD8与AGD9和AGD10同源,并与酵母中的Glo3p密切相关,被称为Glo3p型AGD。酵母双杂交,荧光素酶互补成像（LCI）,GST Pull-down实验证明了 COG4蛋白与G1o3P型ArfGAP蛋白互作,双分子荧光互补（BiFC）表明COG4蛋白与Glo3P型ArfGAP蛋白的互作亚细胞位置在高尔基体上。构建pLAT52::AGD8-GFP载体,将其转入cog4/+突变体中,筛选出转基因植株。结果表明cog4突变导致AGD8在细胞质中弥散。本文研究表明拟南芥COG4在花粉管生长及高尔基体形态维持起重要作用,并且COG4蛋白与G1o3P型ArfGAP蛋白在高尔基体上互作。

关键词：拟南芥花粉管生长 COG复合体 COG4 ArfGAP

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小毛茛雌蕊群的授粉率及花粉管生长途径

云南植物研究 2006年第3期28卷 236-240页

作者：李相时赵博汪小凡武汉大学生命科学学院/植物发育生物学教育部重点实验室武汉430072

为探讨毛茛属中是否具有与慈姑属中类似的花粉管再分配现象，对小毛茛开花后不同时期柱头的授粉率和花粉量进行了统计，并采用荧光显微术观察了其花粉在雌蕊群中的萌发及花粉管生长过程。该种的每朵花中含有39．2±9．9个离生心皮，开... 详细信息

为探讨毛茛属中是否具有与慈姑属中类似的花粉管再分配现象，对小毛茛开花后不同时期柱头的授粉率和花粉量进行了统计，并采用荧光显微术观察了其花粉在雌蕊群中的萌发及花粉管生长过程。该种的每朵花中含有39．2±9．9个离生心皮，开花过程常持续4～6d，开花2d后，柱头授粉率就可达到100％，平均每柱头的花粉量在3d后达到17．0±2．4粒。虽然开花的当天即有少数柱头落置有花粉粒，但花粉萌发常自开花的次日开始。花粉管先沿各雌蕊之向心一侧的组织中穿行至子房基部后部分花粉管转向胚珠，由珠孔进入珠心。从花粉粒落置于柱头到花粉管进入珠心大约需要24h。尽管毛茛属有着与慈姑属类似的多心皮雌蕊群，但大量的荧光显微观察表明，与慈姑属植物中不同的是，小毛茛的花粉管生长均局限于每一雌蕊中而不能穿过子房向其他雌蕊生长。雌蕊群的比较解剖发现：野慈姑的子房基部有一条通向花托表面的孔道，这正是花粉管由一个雌蕊到另一个雌蕊的通路，但小毛茛的子房基部不存在此孔道。

关键词：小毛茛传粉效率花粉管生长花粉管的再分配

细胞外钙调素对雪松花粉萌发和花粉管生长的影响

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细胞外钙调素对雪松花粉萌发和花粉管生长的影响

作者：王宏山东师范大学

学位级别：硕士

本文采用光学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，SDS～PAGE及显微红外光谱分析技术，利用不能透过细胞膜的钙调素的单克隆抗体和大分子拮抗剂W7-agarose，对裸子植物雪松（Cedrus deodara）花粉离体培养时，萌发率、生长速率、胞内钙离子... 详细信息

本文采用光学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，SDS～PAGE及显微红外光谱分析技术，利用不能透过细胞膜的钙调素的单克隆抗体和大分子拮抗剂W7-agarose，对裸子植物雪松（Cedrus deodara）花粉离体培养时，萌发率、生长速率、胞内钙离子分布、蛋白质表达及细胞壁成分的变化进行了观察，表明胞外钙调素在雪松花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要的作用。在培养基中分别加入钙调素的单克隆抗体和W7-agarose后，与生长在正常培养基中的雪松花粉相比，花粉的萌发率和生长速率明显降低，萌发所需要的时间加长，并伴有花粉管的形态异常现象。钙调素的拮抗剂处理后，通过显微红外光谱（FTIR）分析，发现细胞壁酯类物质的含量增加，而酸性果胶质和蛋白质的含量下降。使用SDS-PAGE技术，发现在培养中添加钙调素的单克隆抗体后，花粉管总蛋白的含量下降，这与FTIR检测到的蛋白质含量下降的结果一致，并且发现几条特定蛋白的含量随着钙调素单克隆抗体浓度的增大而逐渐减少。另外，通过在花粉管中装载钙离子荧光指示剂fluo-3AM，利用激光共聚焦显微技术研究了细胞外钙调素对花粉管顶端游离钙离子分布的影响。发现钙调素的单克隆抗体使得花粉管顶端的钙离子梯度消失，由于花粉管顶端的钙离子梯度在花粉萌发和生长过程中起到关键作用，它的消失会抑制花粉的萌发和花粉管的生长，所以我们推测胞外钙调素可能通过影响花粉管顶端钙离子的梯度分布，进一步影响花粉的萌发、蛋白质表达以及形态建成。

关键词：外源钙调素花粉萌发花粉管生长细胞壁激光共聚焦显微镜显微红外光谱分析

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钙和硼对芦荟花粉萌发和花粉管生长的影响

安徽农业科学 2010年第14期38卷 7238-7239,7282页

作者：杨淑娟毛桂莲孙驰宁夏大学生命科学学院宁夏银川750021

[目的]探究钙和硼与芦荟花粉萌发和花粉管生长之间的关系。[方法]分别设置不同浓度的Ca2+和H3BO3,研究不同浓度钙和硼对芦荟花粉萌发和花粉管生长的影响。[结果]在一定浓度范围内,Ca2+对芦荟花粉萌发率和花粉管的伸长均有不同程度的影... 详细信息

[目的]探究钙和硼与芦荟花粉萌发和花粉管生长之间的关系。[方法]分别设置不同浓度的Ca2+和H3BO3,研究不同浓度钙和硼对芦荟花粉萌发和花粉管生长的影响。[结果]在一定浓度范围内,Ca2+对芦荟花粉萌发率和花粉管的伸长均有不同程度的影响。低浓度Ca2+不利于花粉管的生长,而高浓度Ca2+则抑制花粉管生长,其最适Ca2+浓度为1.3×10-3mol/L。在高浓度硼条件下,较长时间内花粉管均呈现出波浪形,花粉管生长的最适硼浓度为1.6×10-4mol/L。[结论]不同浓度的钙和硼,会促进或抑制芦荟花粉萌发和花粉管生长。

关键词：钙硼芦荟花粉萌发花粉管生长

金属离子对4种植物花粉萌发和花粉管生长的影响

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江苏农业科学 2016年第12期44卷 225-227页

作者：周晓明陈慧苏州农业职业技术学院江苏苏州215008 江苏省太湖常绿果树技术推广中心江苏苏州2015107

研究了金属离子Na^+、Al^(3+)、Cu^(2+)对烟草、西府海棠、紫叶李以及日本晚樱花粉萌发、花粉管生长的影响。结果发现:与茄科植物烟草花粉相比,蔷薇科植物西府海棠、紫叶李和日本晚樱花粉对Cu^(2+)更为敏感,0.000 1 mmol/L就能明显抑制... 详细信息

研究了金属离子Na^+、Al^(3+)、Cu^(2+)对烟草、西府海棠、紫叶李以及日本晚樱花粉萌发、花粉管生长的影响。结果发现:与茄科植物烟草花粉相比,蔷薇科植物西府海棠、紫叶李和日本晚樱花粉对Cu^(2+)更为敏感,0.000 1 mmol/L就能明显抑制这3种植物的花粉萌发和花粉管生长,烟草花粉对Cu^(2+)敏感浓度则是0.001 0 mmol/L。然而,2个科物种的花粉对Al^(3+)的表现恰恰相反,蔷薇科植物的花粉对Al^(3+)表现出较高的耐受性,1 mmol/L Al^(3+)才能明显抑制花粉萌发和花粉管生长;而茄科植物烟草则表现得较敏感,抑制浓度为0.01 mmol/L。2个科植物的花粉对Na^+均有很高的耐受力,烟草花粉萌发和花粉管生长在100 mmol/L Na^+处理下才受到明显抑制;对西府海棠和紫叶李花粉,Na^+抑制浓度为10 mmol/L,而日本晚樱花粉在100 mmol/L Na^+情况下仍能正常生长。由此,说明了不同的物种对胞外金属离子存在不同的耐受能力。

关键词：金属离子花粉萌发花粉管生长烟草蔷薇科植物