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芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠TGF-β_1、PDGF表达的调控作用

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解放军医学杂志 2019年第1期44卷 7-12页

作者：张毅李娟张弢苏韫张晶孙少伯颜春鲁赖乾李金田甘肃中医药大学中医临床学院中医临床基础教研室兰州730000 敦煌医学与转化教育部重点实验室兰州730000

目的观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)及血小板衍生生长因子(PDGF)表达的影响,探讨芪蛭皱肺颗粒干预气道炎性反应及气道重塑的作用机制。方法 SPF级Wistar大鼠60只,随机分为空白组(N组... 详细信息

目的观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)及血小板衍生生长因子(PDGF)表达的影响,探讨芪蛭皱肺颗粒干预气道炎性反应及气道重塑的作用机制。方法 SPF级Wistar大鼠60只,随机分为空白组(N组)、模型组(M组)、阳性对照组(D组)和芪蛭皱肺颗粒高(HT组)、中(MT组)、低(LT组)剂量组,每组10只。除空白组外,其余各组采用气管内滴注脂多糖(LPS)联合烟熏法复制大鼠COPD模型。第29天开始模型组、空白组给予生理盐水1ml/100g,阳性对照组给予醋酸地塞米松溶液2.14μg/200g,芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组分别给予芪蛭皱肺混悬液0.432、0.216、0.108g/200g,第58天时采用HE染色观察肺组织形态学的变化,反转录定量PCR法(RT-qPCR)检测大鼠肺组织TGF-β1、PDGF的转录水平,ELISA、Western blotting法检测大鼠肺组织TGF-β1、PDGF蛋白的表达水平。结果各芪蛭皱肺颗粒干预组均可改善COPD大鼠的肺组织病理损害。RT-qPCR显示,与空白组比较,模型组大鼠肺组织TGF-β1和PDGF mRNA表达量(分别为2.54±0.48、2.07±0.39)均明显升高(P芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组TGF-β1mR NA表达量(分别为1.09±0.22、1.13±0.19、1.31±0.29)、PD GFmRNA表达量(分别为1.22±0.16、1.38±0.25、1.44±0.18)均降低(P肺组织TGF-β1和PDGF含量[分别为(315.80±19.20)pg/ml、(105.37±10.84)pg/ml]升高(P芪蛭皱肺颗粒高、低剂量组TGF-β1含量[分别为(228.60±11.20)pg/ml、(253.01±18.02)pg/ml]降低(P芪蛭皱肺颗粒高、中剂量组PDGF含量[分别为(77.25±8.90)pg/ml、(82.36±9.54)pg/ml]降低(P芪蛭皱肺颗粒高、中剂量组TGF-β1和PDGF蛋白表达水平[分别为(1.21±0.08)pg/ml、(1.35±0.15)pg/ml和(1.15±0.11)pg/ml、(1.18±0.13)pg/ml]降低(P芪蛭皱肺颗粒可能通过降低COPD大鼠肺组织TGF-β1和PDGF的表达,抑制肺组织炎性反应,从而干预气道重塑的发生,这可能是其防治COPD的机制之一。

关键词：慢性阻塞性肺疾病转化生长因子β1 血小板衍生生长因子芪蛭皱肺颗粒

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芪蛭皱肺颗粒对COPD模型大鼠血气分析及IL-4细胞因子表达的影响

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中国中医基础医学杂志 2016年第1期22卷 57-58,72页

作者：张毅李娟李金田赵鲲鹏张弢刘永琦魏舒畅苏韫张明渊甘肃中医药大学敦煌医学与转化教育部重点实验室中药药理与毒理学省级重点实验室兰州730000

目的:观察芪蛭皱肺颗粒(QZZF)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型血气分析及肺泡灌洗液(BALF)、血清中IL-4表达的影响,探讨其阻抑COPD的效应及其机制。方法:Wistar大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、苏子降气丸组、罗氟司特组与QZZ... 详细信息

目的:观察芪蛭皱肺颗粒(QZZF)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型血气分析及肺泡灌洗液(BALF)、血清中IL-4表达的影响,探讨其阻抑COPD的效应及其机制。方法:Wistar大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、苏子降气丸组、罗氟司特组与QZZF大、中、小剂量组,采用气管内滴注脂多糖(LPS)加烟熏法复制COPD大鼠模型,造模后第15天开始药物干预,第43天动脉血气分析及检测BALF、血清中IL-4的表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠动脉血p H、Pa O2、Sa O2降低,血清、BALF中IL-4水平升高,差异有统计学意义;Pa CO2、Hct降低不明显,差异无统计学意义。与模型组比较,芪蛭皱肺颗粒中、小剂量组动脉血p H,芪蛭皱肺颗粒大、中、小剂量组Pa O2、Sa O2显著升高,而各个治疗组血清IL-4升高,QZZF中剂量组BALF中IL-4升高,差异有统计学意义。结论:芪蛭皱肺颗粒通过调节血清及BALF中IL-4表达水平,可能是通过减轻气道炎症浸润、提高肺通气和肺换气能力、纠正低氧血症和高碳酸血症,从而干预COPD的发生发展。

关键词：慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒血气分析白细胞介素4

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芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠IFN-γ/IL-4失衡及免疫脏器指数的影响

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中成药 2015年第1期37卷 189-191页

作者：张毅李娟李金田刘光炜张弢刘永琦魏舒畅苏韫甘肃中医学院敦煌医学与转化教育部重点实验室中药药理与毒理学省级重点实验室甘肃兰州730000

目的通过观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型胸腺指数、脾脏指数及肺泡灌洗液(BALF)、血清中IFN-γ/IL-4平衡的影响,探讨芪蛭皱肺颗粒防治COPD的作用机制。方法采用气管内滴注脂多糖(LPS)加烟熏法建立COPD大鼠模型,治疗... 详细信息

目的通过观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型胸腺指数、脾脏指数及肺泡灌洗液(BALF)、血清中IFN-γ/IL-4平衡的影响,探讨芪蛭皱肺颗粒防治COPD的作用机制。方法采用气管内滴注脂多糖(LPS)加烟熏法建立COPD大鼠模型,治疗组自造模第29天起每天给药一次,正常组及模型组给予生理盐水,连续14 d。第43天,检测胸腺指数、脾脏指数及BALF、血清中IFN-γ、IL-4的水平变化。结果与空白组比较,模型组大鼠脾指数、胸腺指数降低(P﹤0.05);与模型组比较,芪蛭皱肺颗粒大、中、小剂量组脾脏指数升高不显著,而芪蛭皱肺颗粒大、中、小剂量组胸腺指数升高明显(P芪蛭皱肺颗粒大、小剂量组血清中及芪蛭皱肺颗粒中剂量组BALF中IFN-γ/IL-4比值明显升高(P芪蛭皱肺颗粒能够提高IFN-γ功能低下,而抑制IL-4功能亢进,调节IFN-γ/IL-4的失衡,从而减轻气道炎症浸润,可能是芪蛭皱肺颗粒防治COPD的机制之一。

关键词：慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒 γ-干扰素白细胞介素-4 免疫脏器指数

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芪蛭皱肺颗粒调控肺泡Ⅱ型上皮细胞NF-κB信号通路的研究

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芪蛭皱肺颗粒调控肺泡Ⅱ型上皮细胞NF-κB信号通路的研究

作者：徐国栋甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)

学位级别：硕士

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种破坏性的肺部疾病,以不完全可逆性的气流受限为特征,通常呈进行性发展,多于有害气体或颗粒导致的肺部异常炎症反应有关。COPD虽然可以进行预防与治疗,但仍具有高... 详细信息

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种破坏性的肺部疾病,以不完全可逆性的气流受限为特征,通常呈进行性发展,多于有害气体或颗粒导致的肺部异常炎症反应有关。COPD虽然可以进行预防与治疗,但仍具有高发病、高致残、高致死率等特点。研究发现,气道和肺实质的慢性炎症是COPD发病的重要机制。有多种炎症介质参与C0PD的发生发展过程,并能引起小气道纤维化及肺结构的破坏,病灶处释放的炎性介质,既会加重肺局部炎症反应,同时也可激活外周血中的炎症细胞,引起全身性的炎症反应。目前的研究发现,调节炎症反应是改善COPD症状、延缓疾病进程的重要途径,而控制炎症介质的释放可能是治疗COPD有效性的体现以及抗炎治疗的作用点。COPD的炎症反应涉及多种细胞,肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell,AT-Ⅱ）是最重要的肺上皮细胞之一,其具有很高的分化潜能,不仅能自我增值,还能转分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞,并参与机体的免疫防御,具有调节肺水转运以及分泌肺表面活性蛋白等功能,在COPD的研究中备受重视。核因子-?B（NF-?B）信号通路广泛存在于机体各类组织中,IL-6、IL-12等多种炎症介质的表达受其调控,其不仅参与机体的炎症反应,还与细胞增殖、抗凋亡等生理效应密切相关。研究认为,调控NF-?B信号通路是抑制肺部炎症反应以及治疗COPD的重要途径之一。本实验就芪蛭皱肺颗粒对AT-Ⅱ细胞NF-?B信号通路的调控作用进行观察,探讨NF-?B信号通路在芪蛭皱肺颗粒控制COPD炎症反应中所起的作用,为探明芪蛭皱肺颗粒防治COPD的作用机制提供实验依据。目的观察芪蛭皱肺颗粒对AT-Ⅱ细胞中NF-?B信号通路的调控及对炎性介质基因转录水平的影响,为探明芪蛭皱肺颗粒对COPD炎症反应的调控作用提供实验依据。方法参照前期实验中的细胞培养方法进行AT-Ⅱ细胞原代培养,用电镜及SP-B免疫组化染色鉴定AT-Ⅱ细胞;选取5瓶生长状态良好的AT-Ⅱ细胞,分为空白组、模型组、芪蛭皱肺颗粒低、中、高剂量组。空白组细胞正常条件培养,其余各组细胞均以20μg/ml LPS进行干预,芪蛭皱肺颗粒给药组在LPS干预2h后,分别给予不同浓度的芪蛭皱肺颗粒,给药浓度依次为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml,各组细胞均在培养36-48h后收集,进行相关检测。（1）倒置显微镜观察细胞一般生长状态,MTT检测细胞活力;电镜及免疫组化SP-B染色鉴定AT-Ⅱ细胞。（2）Q-PCR检测CD14、TLR-4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录水平。结果（1）MTT结果显示,原代培养的AT-Ⅱ细胞在培养前10天内,细胞生长状态良好,在0~72h细胞增殖最为活跃;电镜下观察到,AT-Ⅱ细胞中存在大量深色颗粒,此为AT-Ⅱ细胞特征性结构（板层小体）;原代培养的AT-Ⅱ细胞采用SP-B免疫组化染色后,经显微镜观察发现视野中无未着色细胞,（以细胞内着染棕黄色为阳性结果）,表明以此方法培养的AT-Ⅱ细胞纯度高。（2）Q-PCR结果显示:与正常组比较,模型组CD14、TLR4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,芪蛭皱肺颗粒干预组CD14、TLR4、NF-?B、IL-6、IL-12基因转录水平有不同程度降低,芪蛭皱肺颗粒高剂量组IL-6、IL-12基因转录水平显著降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论（1）本实验选用的AT-Ⅱ细胞,产量好,纯度高,能满足实验研究需要;（2）LPS可导致AT-Ⅱ细胞CD14、TLR4、NF-?B及炎症介质IL-6、IL-12基因转录增加,该作用是由NF-?B信号通路的调控机制来实现;芪蛭皱肺颗粒通过调控NF-?B信号通路中CD14、TLR4、NF-?B及炎症介质IL-6、IL-12的基因转录水平,抑制AT-Ⅱ细胞的炎症反应,该作用可能是芪蛭皱肺颗粒防治COPD的机制之一。

关键词： COPD 肺泡Ⅱ型上皮细胞 NF-?B信号通路芪蛭皱肺颗粒

芪蛭皱肺颗粒通过JAK2-STAT3-RORγt信号通路调控COPD大鼠免疫炎症的机制研究

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芪蛭皱肺颗粒通过JAK2-STAT3-RORγt信号通路调控COPD大鼠免疫炎...

作者：苏苗甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:采用芪蛭皱肺颗粒干预慢性阻塞性肺疾病大鼠,观察其对COPD大鼠炎症反应的影响,并基于JAK2-STAT3-RORγt信号通路探讨其对CD4T细胞向Th17细胞分化的调节作用机制。方法:选用SPF级Wistar大鼠70只,雄性,体重(200±20)g,采用烟熏和联... 详细信息

目的:采用芪蛭皱肺颗粒干预慢性阻塞性肺疾病大鼠,观察其对COPD大鼠炎症反应的影响,并基于JAK2-STAT3-RORγt信号通路探讨其对CD4T细胞向Th17细胞分化的调节作用机制。方法:选用SPF级Wistar大鼠70只,雄性,体重(200±20)g,采用烟熏和联合气管滴注脂多糖的方法建立COPD稳定期模型,造模29天后进行大鼠肺功能指标水平的测定及病理形态变化的测定,确定造模成功。造模成功后随机分组,从第29天开始,进行灌胃干预,每日一次,连续28天后,肺功能检测仪器进行大鼠肺功能指标水平的测定;用苏木素-伊红染色法观察肺组织病理学形态;用蛋白印迹法检测大鼠肺组织中JAK2、STAT3、RORγt的蛋白表达,逆转录聚合酶链反应检测大鼠肺组织中JAK2、STAT3、RORγt m RNA表达;免疫组化法检测JAK2、STAT3、P-STAT3的阳性表达;酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中IL-17A的含量,流式细胞技术检测肺组织CD4T细胞、Th17细胞数量。结果:1.芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺功能检测指标的影响:根据清醒状态下肺功能检测结果显示,与空白组相比较,模型组大鼠肺功能PIF、PEF、EF50、TV、EV、MV均降低,TI、TE、RT、F、Penh均升高,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高剂量组差异明显,均具有统计学意义(P芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织病理变化的影响:与空白组相比,模型组大鼠肺脏组织可见大面积肺泡壁增厚,伴大量炎性细胞浸润,支气管可见上皮细胞坏死,核固缩,胞质空泡化,腔内可见嗜酸性物质,血管周围水肿,伴淋巴细胞浸润,多量肺泡扩张,提示造模成功。各给药组相比于模型组肺组织损坏程度均有明显改善,其中以西药组、中药高剂量组效果最为明显。3.芪蛭皱肺颗粒对各组COPD大鼠肺组织JAK2、STAT3及RORγt m RNA表达的影响:与空白组相比较,模型组大鼠肺组织中JAK2、STAT3、RORγt m RNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织中JAK2、STAT3、RORγt蛋白表达的影响:与空白组相比较,模型组JAK2、STAT3及RORγt的蛋白表达量均升高,差异均具有统计学意义(P芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织中JAK2、STAT3、P-STAT3的阳性表达影响:JAK2、STAT3、P-STAT3的蛋白表达阳性表现为管腔周围有棕褐色颗粒,与空白组相比,模型组大鼠肺组织管腔周围有大量棕褐色颗粒,阳性表达显著升高,差异均具有统计学意义(P颗粒均有不同程度的减少,阳性表达显著降低,差异均具有统计学意义(P芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织中CD4T细胞与Th17细胞数量变化的影响:与空白组相比,模型组大鼠肺组织中CD4T细胞数量明显降低,Th17细胞数量明显升高(P芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠血清中IL-17A含量变化影响:与空白组相比,模型组大鼠血清中IL-17A的含量明显升高(P芪蛭皱肺颗粒通过下调JAK2、STAT3、RORγt、P-STAT3等表达,能抑制CD4T细胞向Th17细胞的分化,从而减少IL-17A等炎症因子的释放,减轻炎症反应,调节免疫平衡,从而对COPD炎症反应具有一定的防治作用。

关键词：慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒 JAK2-STAT3-RORγt信号通路 CD4+ Th17

芪蛭皱肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织KLF2、Nrf2及γ-GCS表达的调控作用

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芪蛭皱肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织KLF2、Nrf2及γ-GCS表达的调控...

作者：张越美甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)模型大鼠肺组织Krüppel样因子2(Krüppel-like factor 2,KLF2)、红系衍生核因子相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gama-Glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)表达的影响,分析并探讨芪蛭皱肺颗粒在COPD氧化应激状态下的抗氧化机理,为COPD的发病机理及治疗提供新的理论依据。方法将60只SPF级Wistar雄性大鼠按照随机数字表法抽取10只作为空白组,剩余50只作为造模大鼠,采用复合因素诱导法,即在气管内注入脂多糖联合烟熏,以此复制COPD大鼠模型。第28 d造模结束,将剩余大鼠随机分为模型组、阳性对照组、芪蛭皱肺高、中、低剂量组。第29 d开始药物干预,空白组和模型组给予与用药组相同体积生理盐水;阳性对照组给予醋酸地塞米松溶液;芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组分别给予不同浓度的芪蛭皱肺颗粒溶液灌胃。药物干预28 d后检测各组大鼠麻醉状态肺功能的变化,颈椎脱臼处死后采集肺组织标本,运用Q-PCR法检测肺组织中KLF2、Nrf2、γ-GCS m RNA的表达,Western Blot法检测肺组织中KLF2、Nrf2、γ-GCS蛋白的表达,免疫组化法检测肺组织中KLF2、Nrf2蛋白的表达。结果1.大鼠一般状态观察与空白组比较,模型组大鼠毛色黯淡无光泽,精神状态较差,嗜卧少动,喜扎堆,反应迟缓,呼吸急促过快、气道分泌物增加,体重有所下降。与模型组比较,阳性对照组与芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组大鼠毛色、呼吸、精神状态以及体重均有不同程度的改善,并且芪蛭皱肺组优于阳性对照组。2.大鼠肺功能变化与空白组比较,模型组大鼠PIF、PEF、EF50、TV、EV、Cdyn均降低,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组均升高,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中剂量组均升高,差异亦有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中剂量组降低,差异具有统计学意义(P肺组织KLF2、Nrf2、γ-GCS m RNA表达的变化与空白组比较,模型组KLF2、Nrf2和γ-GCS m RNA的表达均升高,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组表达均降低,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组表达降低,差异有统计学意义(P肺组织KLF2、Nrf2、γ-GCS蛋白表达的变化Western Blot结果显示:与空白组比较,模型组KLF2、Nrf2和γ-GCS蛋白表达均升高,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组的表达均降低,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组的蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P芪蛭皱肺高、中、低剂量组KLF2、Nrf2蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P芪蛭皱肺颗粒可以改善COPD大鼠的一般情况和肺功能,减缓氧化应激的速度,提高机体抗氧化能力。2.芪蛭皱肺颗粒对COPD有抗氧化作用,其机制可能通过激活KLF2、Nrf2的表达,以促进γ-GCS的活化,增加体内抗氧化物质,以调节氧化/抗氧化失衡,从而减缓COPD的发生、发展以及恶化。

关键词：慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒 Krüppel样因子2 红系衍生核因子相关因子2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

芪蛭皱肺颗粒对LPS诱导致炎肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖和生物学活性的影响

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芪蛭皱肺颗粒对LPS诱导致炎肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖和生物学活性...

作者：曾静玲甘肃中医学院

学位级别：硕士

目的探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的原代培养方法。通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造细胞炎症模型，芪蛭皱肺颗粒给药干预，观察其对致炎AT-Ⅱ细胞形态学、生长周期、线粒体活性、肺泡... 详细信息

目的探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的原代培养方法。通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造细胞炎症模型，芪蛭皱肺颗粒给药干预，观察其对致炎AT-Ⅱ细胞形态学、生长周期、线粒体活性、肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的影响。以探察其防治慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease,COPD)的作用机制，同时为开发研究芪蛭皱肺颗粒提供药效学基础。方法取SPF级新生Wistar大鼠肺脏，采用胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离AT-Ⅱ细胞，免疫黏附结合反复贴壁法纯化细胞，体外培养细胞，透射电镜鉴定细胞。细胞造模方法：10组生长状态及数目接近的细胞，2组不加LPS，2组加5ug/ml的LPS，2组加10ug/ml的LPS，2组加20ug/ml的LPS，2组加40ug/ml的LPS，干预1天。第二天，向用5种浓度LPS干预过的细胞其中一组加入100ug/ml的芪蛭皱肺颗粒，干预2天，同浓度的另一组作对照。观察并检测各组AT-Ⅱ细胞的形态学改变，板层小体、线粒体和生长周期的变化，以及SP-A的表达。结果(1)原代培养的AT-Ⅱ细胞生长状态良好。(2)电镜下观察到板层小体。LPS组板层小体数目减少，芪蛭皱肺颗粒干预组其数目有所增加。(3)MTT显示，LPS组AT-Ⅱ细胞出现异常增殖情况，且其增殖率随LPS浓度的升高而加强。芪蛭皱肺颗粒干预后，细胞增殖受到了抑制，增殖率有所下降。(4)细胞周期检测结果显示，LPS组AT-Ⅱ细胞的细胞周期处于G2期和S期的百分比较高。其增殖百分比随着LPS浓度的升高而上升。芪蛭皱肺颗粒干预后，G2期和S期的百分比有所下降。(5)激光共聚焦显微镜观察线粒体罗丹明123染色结果显示，空白组细胞的线粒体活性强，荧光亮度高。LPS组随着其浓度的升高，荧光强度逐渐减弱。加入芪蛭皱肺颗粒干预后，荧光强度有所恢复。(6)SABC免疫组化法检测SP-A显示：①DAB显色：空白组的AT-Ⅱ细胞质内可以观察到较多的棕黄色颗粒。空白加芪蛭皱肺颗粒组细胞内可见较空白组更多的棕黄色颗粒，颜色较深。而LPS组细胞内棕黄色颗粒明显减少，且LPS浓度越高，其棕黄色颗粒越少、颜色越浅。芪蛭皱肺颗粒干预组的细胞内，棕色颗粒较之同浓度LPS诱导组有所增加，且颜色有一定加深。②FITC荧光染色：空白组的AT-Ⅱ细胞荧光较强。空白加芪蛭皱肺颗粒组细胞荧光强度较空白组更大。而LPS组细胞荧光强度减弱，且随着LPS浓度的增高，荧光越来越淡，芪蛭皱肺颗粒干预组细胞的荧光强度较之同浓度LPS诱导组有所增加。结论本次实验提取的原代AT-Ⅱ细胞符合体外实验要求，第242h内处于最佳生长状态，是进行实验研究的理想时间段。LPS可以促使AT-Ⅱ细胞产生炎症反应而异常增殖，并减弱AT-Ⅱ细胞的SP-A表达，降低该细胞的生物学活性。芪蛭皱肺颗粒对LPS诱导致炎肺泡Ⅱ型上皮细胞的异常增殖有抑制作用，可改善细胞超微结构，促进SP-A表达，有助于提高AT-Ⅱ细胞的生物学活性。

关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞周期表面活性蛋白A 慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒

芪蛭皱肺颗粒对LPS致炎AT-Ⅱ细胞p38MAPK信号通路的影响

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芪蛭皱肺颗粒对LPS致炎AT-Ⅱ细胞p38MAPK信号通路的影响

作者：陈丽娜甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)

学位级别：硕士

目的:原代培养新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell,AT-Ⅱ）,利用内毒素（lipopolysaccharide,LPB）作用建立体外炎症模型,通过芪蛭皱肺颗粒干预细胞,观察AT-Ⅱ细胞形态学变化,p38MAPK信号通路基因的表达变化,探... 详细信息

目的:原代培养新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell,AT-Ⅱ）,利用内毒素（lipopolysaccharide,LPB）作用建立体外炎症模型,通过芪蛭皱肺颗粒干预细胞,观察AT-Ⅱ细胞形态学变化,p38MAPK信号通路基因的表达变化,探讨芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）的作用机制,为开发研究芪蛭皱肺颗粒提供药效学基础。方法:取新生SPF级大鼠乳鼠肺脏,采用胰酶联合胶原酶消化法获取AT-Ⅱ细胞,分离纯化后进行体外培养,用电镜观察鉴定AT-Ⅱ细胞。取生长状况接近的同一代细胞,设置空白组、模型组（LPS 20ug/ml）、低剂量组（LPS 20ug/ml+芪蛭皱肺颗粒50 ug/ml）、中剂量组（LPS 20ug/ml+芪蛭皱肺颗粒100 ug/ml）、高剂量组（LPS 20ug/ml+芪蛭皱肺颗粒200 ug/ml）。电镜观察各组AT-Ⅱ细胞生长状态,透射电镜观察板层小体的变化,免疫组化法检测SP-B,Q-PCR法定量检测各组AT-Ⅱ细胞p38、SP-B及Fas基因表达水平,用Western Blot法半定量检测各组AT-Ⅱ细胞p38、SP-B蛋白表达水平。结果:1、成功分离培养大鼠乳鼠原代AT-Ⅱ细胞,生长状态良好;2、LPS成功建立COPD体外炎症模型,电镜观察细胞发现,与正常组对比,模型组AT-Ⅱ细胞板层小体减少,出现空泡样改变;与模型组对比,低、中、高剂量组板层小体减少不显著,出现空泡样改变减少;3、与正常组对比,模型组SP-B基因表达降低,p38、FAS基因表达升高（P﹤0.05）;与模型组对比,芪蛭皱肺颗粒低、中、高剂量组能上调SP-B基因的低水平表达（P﹤0.05）,下调p38、FAS基因的高水平表达。结论:LPS干预原代培养大鼠乳鼠AT-Ⅱ细胞,可诱导AT-Ⅱ细胞的炎性反应,改变细胞超微结构,建立COPD体外炎症模型,芪蛭皱肺颗粒颗粒能抑制AT-Ⅱ细胞超微结构的改变,上调SP-B基因表达,调控p38、FAS基因的高水平表达,减轻炎症反应,提高AT-Ⅱ细胞生物学活性。

关键词：慢性阻塞性肺疾病 AT-Ⅱ细胞 p38MAPK 芪蛭皱肺颗粒 Fas SP-B

芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织微血管新生的影响

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芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织微血管新生的影响

作者：黄人鹤甘肃中医学院

学位级别：硕士

目的：通过观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠肺组织病理形态学、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达和转录水平及微血管密度（MVD）的影响，初步探讨芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠模型的治疗作用及其对微血管新生的影响机制... 详细信息

目的：通过观察芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠肺组织病理形态学、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达和转录水平及微血管密度（MVD）的影响，初步探讨芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠模型的治疗作用及其对微血管新生的影响机制。方法：将60只SPF级Wistar大鼠随机分为6组：空白组、模型组、阳性对照组、芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组，每组10只。采用香烟烟熏加气管内滴注脂多糖（LPS）的复合因素造模法建立COPD大鼠模型。实验第15天起空白组、COPD模型组给予生理盐水灌胃，阳性对照组给予罗氟司特溶液灌胃，芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组分别给予不同浓度混悬液进行灌胃，干预治疗满4周，于第43天处死大鼠，采集标本。分别以HE染色，MASSON染色、透射电镜观察肺组织病理形态学及超微结构变化，免疫组化SABC法检测大鼠肺组织VEGF及MVD的表达，用RT-PCR法检测VEGF转录水平，用免疫荧光染色法检测大鼠肺组织中SP-A的表达。结果： 1．肺组织病理形态学的影响：HE染色模型组可见肺组织部分区域肺泡高度扩张，肺泡间隔狭窄、断裂，肺泡壁毛细血管受压闭合，呈重度的肺气肿表现;细支气管痉挛收缩，管腔狭窄;间质小血管管壁增厚、硬化;细支气管管壁、血管周围及间质见大量淋巴细胞、巨噬细胞灶状浸润。阳性对照组可减轻炎性细胞浸润，但效果不明显。芪蛭皱肺颗粒高剂量组可明显减轻炎症细胞浸润，抑制小血管管壁增厚，明显改善细支气管管腔狭窄。Masson染色可见模型组肺泡间质、小支气管、细小支气管及其周围胶原纤维沉积较空白组明显增多;芪蛭皱肺颗粒各治疗组则可明显抑制肺泡间质、小支气管胶原纤维的增加。透射电镜可见模型组胞质内线粒体肿胀，线粒体嵴断裂或消失，板层体明显减少并伴有局灶性溶解，质膜边缘绒毛样突起明显减少。与模型组比较，芪蛭皱肺颗粒高剂量组肺泡Ⅱ型上皮细胞结构相对完整，线粒体肿胀不明显，板层体空泡化减少，微绒毛数量明显增多。 ***：与空白组比较，模型组MVD显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比较,阳性对照组MVD降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。芪蛭皱肺颗粒高剂量组与模型组相比较MVD显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 ***：免疫组化染色可见模型组大鼠肺组织VEGF表达较空白组明显增强，有显著性差异（P＜0.01）;阳性对照组VEGF表达水平在模型组与中药治疗组之间，与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）;芪蛭皱肺颗粒高剂量组与模型组比较VEGF表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与空白组比较，模型组大鼠肺组织VEGFmRNA的表达增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较，芪蛭皱肺颗粒高、中剂量组VEGFmRNA的表达减少，差异亦有统计学意义（P＜0.05）。 ***-A：与空白组比较，模型组大鼠肺组织SP-A荧光表达及SP-A平均肺泡阳性细胞数明显降低，有显著性差异（P＜0.01）;与模型组比较，阳性对照组SP-A平均肺泡阳性细胞数增加，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，芪蛭皱肺颗粒高、中剂量组SP-A荧光表达增强，SP-A平均肺泡阳性细胞数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论： 1、本实验采用烟熏加气管内滴注脂多糖成功建立了具有微血管新生现象的COPD大鼠模型。 2、大鼠COPD发病过程中微血管新生促进因子VEGF的表达上调，肺组织微血管新生活跃，说明微血管新生可能是COPD发病过程中一个重要环节，抑制微血管新生可能会从一定程度上延缓COPD进展。 3、芪蛭皱肺颗粒治疗COPD的可能机制之一是通过抑制VEGF的表达和MVD，进而抑制病理性微血管新生，达到治疗COPD的目的，且存在量效关系，以高剂量组效果最佳。 4、芪蛭皱肺颗粒可能通过增加SP-A蛋白表达，抑制炎性细胞和介质合成，延缓肺抗氧化损伤等机制改善肺功能，保护肺组织。

关键词：慢性阻塞性肺疾病芪蛭皱肺颗粒血管内皮生长因子微血管密度肺表面活性物质相关蛋白A