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核基质结合区对转爬山虎芪合酶基因烟草中产生白藜芦醇的作用

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Acta Botanica Sinica 2004年第8期46卷 948-954页

作者：钟瑾刘树君马世嵩杨巍胡鸢雷吴锜林忠平北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京100871

采用核基质结合区(MARs)来提高转芪合酶基因(STS)烟草(Nicotiana tabacum L．)中白藜芦醇产物的含量。MARs是细胞中能与核基质特异紧密结合的DNA片段，体外结合实验表明克隆自酵母的MARs序列能特异地与烟草核基质结合。芪合酶是白藜芦... 详细信息

采用核基质结合区(MARs)来提高转芪合酶基因(STS)烟草(Nicotiana tabacum L．)中白藜芦醇产物的含量。MARs是细胞中能与核基质特异紧密结合的DNA片段，体外结合实验表明克隆自酵母的MARs序列能特异地与烟草核基质结合。芪合酶是白藜芦醇生物合成中的关键酶，用RT-PCR方法从川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana(Hemsl．)Dielset Gilg)中克隆了与葡萄芪合酶基因有较高同源性的芪合酶编码区，将其置于CaMV35SΩ强启动子下，分别构建两侧带有MARs及不含MARs序列的表达载体，通过农杆菌介导转化烟草。Northern blot及HPLC等分析表明STS基因已整合至烟草染色体中并正常转录，且表达的外源芪合酶在烟草中可催化其底物合成白藜芦醇产物。与对照相比，MARs的存在使转芪合酶基因烟草中白藜芦醇的含量平均提高了约一倍。MARs在转芪合酶基因植物中的应用也为获得抗病性更强、白藜芦醇含量更高、更保健的转基因果蔬的研究奠定了基础。

关键词：核基质结合区芪合酶基因白藜芦醇川鄂爬山虎转基因烟草酵母

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芪合酶基因的分子生物学研究

生物技术通报 2009年第11期25卷 24-29页

作者：生书晶赵树进华南理工大学生物科学与工程学院广州510640 中国人民解放军广州军区广州总医院广州510010

植物中存在芪类次生代谢产物(stilbenes)作为一种重要的植保素,不仅能够使植物体本身的抗逆性提高,在人类健康医疗领域也有很好的应用前景。由于其合成途径具有专一性,需要芪合酶(Stilbene synthase,STS)的存在,近年来芪合酶基因工程日... 详细信息

植物中存在芪类次生代谢产物(stilbenes)作为一种重要的植保素,不仅能够使植物体本身的抗逆性提高,在人类健康医疗领域也有很好的应用前景。由于其合成途径具有专一性,需要芪合酶(Stilbene synthase,STS)的存在,近年来芪合酶基因工程日益引起人们的研究和重视。介绍了芪合酶基因的结构功能及其诱导表达的调控机理,并对其转基因工程的研究进展进行了综述,以期为进一步开展芪类次生代谢物在作物品质改良及人类健康营养中的应用提供参考。

关键词：芪类次生代谢物芪合酶基因代谢调控转基因工程

中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

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中国农业科学 2021年第2期54卷 310-323页

作者：丁茜赵凯茜王跃进西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业农村部西北地区园艺作物生物与种质创制重点实验室

【目的】克隆中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤-2’芪合酶(stilbene synthase)基因(STS)并研究其功能,为提高欧洲葡萄(V. vinifera)的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合... 详细信息

【目的】克隆中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤-2’芪合酶(stilbene synthase)基因(STS)并研究其功能,为提高欧洲葡萄(V. vinifera)的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植物过表达载体;用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织,作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料,获得抗性植株,经过不同水平检测,确定转基因植株;对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌(Uncinula necator),通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况,比较两者对白粉病的抗性;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后STS及其相关基因的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。【结果】同源序列克隆得到VqSTS9(JQ868689)与VqSTS21(JQ868677)的cDNA序列,长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测,鉴定出过表达VqSTS9无核白植株4株和过表达VqSTS21无核白植株3株。显微观察发现,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株叶片上的菌丝生长较慢,表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明,自然生长条件下,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株STS的表达量提高,STS上游苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、下游白藜芦醇糖基转移酶基因(RSGT)、转录因子基因(MYB14、MYB15)的表达量均不同程度上升,而查尔酮合成酶基因(CHS)表达量降低;人工接种白粉病菌后,与野生型植株相比,转基因植株STS表达量显著上调。高效液相色谱分析表明,自然条件下,芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在,转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株;在接种白粉病菌诱导表达后,除了反式云杉新苷,还产生了反式白藜芦醇和葡萄素,即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。【结论】将VqSTS9、VqSTS21转入无核白后,转基因植株STS的表达量增高,芪类物质的含量与种类增加,并抑制白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的VqSTS9和VqSTS21能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性,‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。

关键词：中国野生毛葡萄芪合酶基因白藜芦醇白粉病遗传转化抗病性

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中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

园艺学报 2020年第2期47卷 205-219页

作者：吴凤颖刘梦琦王跃进西北农林科技大学园艺学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室农业农村部西北地区园艺作物生物与种质创制重点实验室陕西杨凌712100

中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤–2’白藜芦醇含量高,并抗白粉病。以此为材料,利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因VqSTS12和VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化,分... 详细信息

中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤–2’白藜芦醇含量高,并抗白粉病。以此为材料,利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因VqSTS12和VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化,分别获得7个VqSTS12和5个VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量PCR分析发现,与野生型植株相比,转基因植株中芪合酶基因STS与下游白藜芦醇糖基转移酶基因RSGT表达量升高,与STS有底物竞争关系的查尔酮合酶基因CHS表达量降低。STS的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现,转基因植株对白粉菌的敏感性降低,发病较晚,病情较轻,在转基因植株上部分孢子萌发受抑制,菌丝发育迟缓。转基因植株中VqSTS12和VqSTS25受白粉菌诱导表达:在接菌后1~3 d内表达量显著升高,随后略有下降,在6~7 d表达量再次上升。同时高效液相色谱(HPLC)检测到STS的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄VqSTS12和VqSTS25及其表达的芪类物质具有抑制白粉菌的作用。

关键词：毛葡萄芪合酶基因白藜芦醇抗病性白粉病

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芪合酶基因的克隆及原核表达研究

黑龙江畜牧兽医 2006年第11期 100-102页

作者：刘勇刘林丽龚月生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

白黎芦醇是一些种子植物对受伤做出反应时产生的一种植保素。研究结果表明，白黎芦醇不仅能够使植物对某些疾病（如灰霉病）产生抗性，而且具有明显的抗氧化作用，还具有调节脂肪代谢，抑制血小板凝集和血管舒张，调节脂蛋白代谢等多种... 详细信息

白黎芦醇是一些种子植物对受伤做出反应时产生的一种植保素。研究结果表明，白黎芦醇不仅能够使植物对某些疾病（如灰霉病）产生抗性，而且具有明显的抗氧化作用，还具有调节脂肪代谢，抑制血小板凝集和血管舒张，调节脂蛋白代谢等多种生物学功能。因此，为了利用白黎芦醇特有的生物学功能，试验通过人工合成的芪合酶基因，构建原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，并用IPTG诱导使其高效表达。

关键词：原核表达载体芪合酶基因生物学功能克隆白黎芦醇种子植物抗氧化作用脂肪代谢

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芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建

热带作物学报 2003年第2期24卷 42-45页

作者：谭琳郑学勤康由发施江海南医学院生化教研室中国热带农业科学院生物技术国家重点实验室海口571101

为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄,进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种———雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA,并以其为模板,经PCR扩增芪合酶基因,各获得一长约1.6Kb的片段... 详细信息

为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄,进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种———雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA,并以其为模板,经PCR扩增芪合酶基因,各获得一长约1.6Kb的片段,将这2个片段分别连接到pGEM-Teasy和pUCm-T上进行测序,1个片段长为1622bp(命名为S1),另一个片段长为1617bp(命名为S2)。然后将S1正向插入pEV2的果实特异性启动子TFP2和NOS终止子,构建了植物表达载体pEV2S1;将S2正向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBS2。将重组体pEV2S1和pBS2转化大肠杆菌***1,并对重组体进行了筛选和鉴定。

关键词：芪合酶基因基因克隆植物表达载体转基因番茄白藜芦醇基因转化

芪合酶基因的遗传转化及其转基因烟草抗真菌病害特性研究

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芪合酶基因的遗传转化及其转基因烟草抗真菌病害特性研究

作者：周文丽西北农林科技大学

学位级别：硕士

烟草根黑腐病以及烟草赤星病是两种世界烟区内广泛发生的严重病害。烟草根黑腐病严重时发病率可达30%以上,赤星病也是烟草的主要病害之一，它们都给我国的烟草行业带来了巨大损失。芪合酶(Stilbene synthase, STS)是植物体内起植保素... 详细信息

烟草根黑腐病以及烟草赤星病是两种世界烟区内广泛发生的严重病害。烟草根黑腐病严重时发病率可达30%以上,赤星病也是烟草的主要病害之一，它们都给我国的烟草行业带来了巨大损失。芪合酶(Stilbene synthase, STS)是植物体内起植保素作用的芪类化合物合成的关键酶，它与植物的抗病性有密切关系。白藜芦醇(3’-4’trans-resveratrol)由芪合酶催化底物合成，能抑制植物病原真菌菌丝的生长及孢子的萌发。在普通栽培烟草品种中有芪合酶的作用底物，却没有芪合酶基因，而只有芪合酶的催化，才能生成抗菌化合物及与抗病性相关的芪类化合物，因此导入的芪合酶基因能促进抗菌化合物白藜芦醇及抗病性相关的芪类化合物的合成，从而提高植物的抗病性。本研究以普通烟草“97204”的叶片为受体，通过根癌农杆菌介导法，将中国野生葡萄芪合酶基因转入普通烟草品种97204中，并对转基因烟草抗根黑腐病、赤星病的特性进行研究，并研究了根黑腐病病原菌接种条件下，转基因烟草与抗病相关的酶的活性，获得了主要研究结果如下： 1．以普通烟草“97204”的离体叶片为受体，进行了烟草野生葡萄芪合酶基因遗传转化中，卡那霉素(Kam)水平的敏感性试验，结果表明：30mg/L的Kam是烟草“97204”农杆菌介导转化植株抗性筛选的最佳浓度;而20mg/L的Kam是烟草“97204”转化植株筛选生根的最佳浓度。 2.优化了芪合酶基因遗传转化普通烟草“97204”的条件：将培养好的菌液与20mLMS液体培养基1：1混合，摇匀后放置片刻，将烟草叶片消毒后用无菌水洗4遍后切成1cm×1cm的小块，放入稀释好的菌液中浸染7min，后用无菌滤纸吸去叶片表面菌液，转移至诱导培养基上，于26℃共培养2d;后用无菌水洗4次，转到400mg/LCb的MS液体培养基中浸泡6min取出，无菌滤纸吸干叶片表面水分，于诱导筛选培养基上诱导分化培养;待分化的烟草苗长到3cm左右时转到筛选、生根培养上生根。 3.通过农杆菌介导、抗性选择获得了157株抗性再生植株，以157个抗性植株和对照(阴性对照)叶片的总DNA为模板，以含有目的基因的质粒为阳性对照进行PCR扩增。结果表明，有32个抗性植株扩增出的特异性条带与质粒相同，其分子质量为1185bp，初步证明了野生葡萄芪合酶基因已整合到普通烟草品种“97204”的基因组中。 4.转野生葡萄芪合酶基因烟草的抗根黑腐病试验表明：4株用于抗病性鉴定的转基因烟草中，灌根接种后2株生长正常，其中有3株的根部无发病症状，另1株根部在接种16d后出现了发黑症状，而接种后对照叶片第3d就出现了黄化和萎蔫的症状，对照植株15d几乎死亡。 5.转基因烟草抗赤星病试验表明:离体叶片接种赤星病病原菌3d后，非转基因烟草叶片发病严重，4株转基因烟草中有2株转基因烟草叶片明显不发病，表现对赤星病较强的抗病性。 6.转基因烟草抗根黑腐病试验中，进行了与抗病性相关的酶的活性测定，结果表明：转基因烟草的PAL、PPO活性本底均高于对照，在接种后40dPAL保持在一个高的酶活性水平，酶活性10d后又迅速下降，对照有着相似的变化，但其变化幅度小;在接种2d后转基因烟草的PPO活性迅速升高，并且在接种6d时达到峰值，后开始下降;转基因烟草叶片在接种前的POD活性高于对照,在接种1d时，POD活性缓慢上升，9d时达到峰值，后又下降;而接病后非转因烟草在的POD活性没有发生较大变化;转基因烟草叶片的CAT活性在接种前也明显高于对照，在接种第3d转基因及非转基因烟草的CAT活性均达到最大值，且随后开始下降，后又上升。 7.将经过PCR检查得到的18株转基因苗移栽至大田，转基因株生长发育正常，秋季收获到转基因烟草的T1代种子。

关键词：普通烟草芪合酶基因遗传转化真菌病害抗病性酶活性

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芪合酶基因转化小白菜

农业生物技术学报 2006年第2期14卷 231-234页

作者：胡小平商文静蔡文启韩青梅康振生西北农林科技大学植物保护学院中国科学院微生物研究所西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室

利用质粒pBin438构建了含有NPTⅡ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(***)品种中,经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测,RS基因已整... 详细信息

利用质粒pBin438构建了含有NPTⅡ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(***)品种中,经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测,RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达,共获得了7株转基因植株。

关键词：小白菜转基因植株芪合酶基因

中国野生毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因表达与功能分析

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西北植物学报 2016年第2期36卷 215-224页

作者：杜杨建李瑞民程思妍张剑侠王跃进西北农林科技大学园艺学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室陕西杨陵712100

为了研究中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd.)‘丹凤-2’3个芪合酶基因的表达与功能,该研究采用同源克隆技术分离了毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32(GenBank登录号分别为JQ868677、JQ868668和JQ868666),3个基因的cDNA全长均为1 179bp,编码392个氨基酸。以抗葡萄白粉病(Uncinula necator)的毛葡萄‘丹凤-2’和不抗病的欧洲葡萄‘赤霞珠’为材料分别进行接种白粉菌和ABA、SA、MeJA、高温、低温和高盐胁迫处理,利用实时定量PCR检测这3个基因在胁迫处理下的表达情况;同时利用农杆菌介导法将这3个基因分别转入模式植物烟草中,检测这3个基因在烟草中的表达产物,分析比较这3个基因的表达功能。结果显示:在2个供试材料中,葡萄白粉菌胁迫下芪合成酶VqSTS32诱导表达量高于VqSTS21和VqSTS30;在非生物胁迫处理下,芪合酶基因VqSTS32对高温处理反应最敏感。采用高效液相色谱分析检测转3个基因烟草的结果显示,转VqSTS32基因烟草比转VqSTS30基因烟草植株中白藜芦醇的累积量高。研究表明,3个基因中VqSTS32具有较高的抗葡萄白粉菌特性并能在转基因烟草中表达出较高的反式云杉新苷产物,这为进一步利用VqSTS32转目的植物葡萄基因研究提供了依据。

关键词：葡萄中国野生葡萄芪合酶基因白藜芦醇表达分析