检索结果-南通市图书馆

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

芦丁降解酶的固定化及其酶学特性研究

芦丁降解酶的固定化及其酶学特性研究

作者：崔会东西北农林科技大学

学位级别：硕士

苦荞是唯一作为粮用的蓼科(Polygonaceae)植物,是我国西部重要的药食兼用作物。黄酮类化合物是苦荞最主要的生物活性成分,赋予苦荞降血压,降血脂和降血糖等生理功能。苦荞中含有高活性的芦丁降解酶,该酶能专一性将芦丁水解为槲皮素和芸... 详细信息

苦荞是唯一作为粮用的蓼科(Polygonaceae)植物,是我国西部重要的药食兼用作物。黄酮类化合物是苦荞最主要的生物活性成分,赋予苦荞降血压,降血脂和降血糖等生理功能。苦荞中含有高活性的芦丁降解酶,该酶能专一性将芦丁水解为槲皮素和芸香糖。本论文研究了利用有载体和无载体两种条件下固定芦丁降解酶,并对固定化条件进行优化,研究了固定化酶的酶学特性。在有载体固定化中,采用共价结合法,以壳聚糖为载体固定化芦丁降解酶,分别在单因素试验的基础上进行了正交试验,确定了最佳工艺条件,结果表明:最适酶量和固定化pH对固定化酶活力影响高度显著,固定化温度和戊二醛浓度对固定化酶活力有影响,活化时间、活化温度和固定化时间对固定化酶影响最小,综合起来考虑,最优水平为戊二醛的浓度3%,活化时间1小时,活化温度30℃,酶浓度340μg/ml,固定化pH4.0时,固定化温度20℃,固定化时间5小时,酶活力回收率最高。将壳聚糖固定化酶和游离酶进行比较,结果显示壳聚糖固定化芦丁降解酶和游离酶最适温度分别为60℃和50℃,游离酶的最适pH为4.0,而固定化酶的最适pH为3.5。固定化酶的热稳定性提高,耐酸碱性范围扩大,更耐酸。在无载体固定化中,以交联酶聚集体作为固定化方法,在单因素试验的基础上进行正交试验,结果表明:pH对固定化酶活力的影响高度显著,交联温度对固定化有影响,戊二醛浓度、牛血清白蛋白浓度和交联时间及硫酸铵浓度对固定化影响最小,综合考虑,固定化最优水平为戊二醛的浓度0.5%,交联时间3小时,牛血清白蛋白浓度0.1mg/ml,固定化温度20℃,硫酸铵浓度100%,给酶量170μg/ml,固定化pH7时,酶活力回收率最高。将交联酶聚集体和游离酶进行比较,结果显示交联酶聚集体和游离酶最适温度无明显变化,均为50℃左右,交联酶聚集体的最适pH为3.8。热稳定性提高,耐酸碱性范围扩大。游离酶和交联酶的Km值分别分别为3.521μmolml-1和3.753μmol ml-1 ,说明交联芦丁降解酶聚集体和游离芦丁降解酶的对底物的亲合力只是微小的变化。对壳聚糖固定化的芦丁降解酶和交联酶聚集体进行比较,从制备流程来看,交联酶聚集体方法相对简单;从重复使用性上来看,壳聚糖球易破裂,重复使用效果差;从酶活力回收率来看,当游离酶酶比活力为346.52U/mg时,超过98%的游离酶被固定,交联酶聚集体比活力为323.06U/mg,活力回收率高,而壳聚糖为载体固定化仅有8%的酶被固定,酶活力回收率低,因此交联酶聚集体是固定化芦丁降解酶的较为适宜的方法。此外固定化酶对多种有机试剂的耐受性高于游离酶,这些结果为研究芦丁降解酶的非水酶学特性奠定了基础,同时该研究结果为利用苦荞芦丁降解酶酶法生产槲皮素以及拓展生物催化领域酶的种类有具有重要的理论意义和指导价值。

关键词：苦荞芦丁降解酶固定化酶壳聚糖交联芦丁降解酶聚集体

芦丁降解酶在毕赤酵母中的表达及其催化机制分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

芦丁降解酶在毕赤酵母中的表达及其催化机制分析

作者：王媛西北农林科技大学

学位级别：硕士

芦丁降解酶(rutin degrading enzymes,RDEs)是苦荞黄酮代谢途径中的关键酶,具有严格的底物特异性,能水解芦丁的3-O糖苷键,生成芦丁二糖和槲皮素。RDE不仅在植物体内发挥关键作用,而且RDE的体外芦丁水解活性和转糖基化活性使其在食品添... 详细信息

芦丁降解酶(rutin degrading enzymes,RDEs)是苦荞黄酮代谢途径中的关键酶,具有严格的底物特异性,能水解芦丁的3-O糖苷键,生成芦丁二糖和槲皮素。RDE不仅在植物体内发挥关键作用,而且RDE的体外芦丁水解活性和转糖基化活性使其在食品添加剂、药物合成等方面具有潜在的应用价值。本研究在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)SMD1168H中进行RDE的重组表达,通过定点突变技术研究了RDE的活性中心的关键氨基酸位点,并且通过预测的N-糖基化修饰位点突变研究糖基化修饰对RDE的稳定性和酶活力的影响。此外,为了进一步研究RDE在植物体内的生物学功能,构建了RDE的基因敲除载体pBSE401-RDE和植物过表达载体pCAMBIA3301-RDE,在苦荞叶肉细胞原生质体和在模式植物烟草中进行了瞬时表达,并且转化烟草,为研究RDE在植物体内的生物学功能奠定基础。主要的研究结果如下:本研究在*** SMD1168H中实现了RDE的分泌表达,重组芦丁降解酶(recombinant RDE,rRDE)表达量为21.5 mg/L,通过测定rRDE与天然RDE(native RDE,nRDE)在不同底物浓度下的酶活力,rRDE的Km值为1.56mmol·L,Vmax值为3.27 mmol·L·s,nRDE的Km值为2.04 mmol·L,Vmax值为4.19 mmol·L·s,表明rRDE与nRDE不同的翻译后修饰影响rRDE催化芦丁水解。酶学性质分析显示rRDE与nRDE相似,最适反应温度为50°C,最适pH值为5.5。N-酰胺酶PNGase F处理的后的rRDE表观分子量变小,且与nRDE大小相近,表明***系统中分泌表达的rRDE存在蛋白质N-糖基化修饰作用。通过SWISS-MODLE同源建模,结合已有的β-糖苷酶的结构和功能研究,预测两个关键氨基酸位点E171和E382。基于该预测,通过QuikChange site directed mutagenesis使用部分重叠引物引入E171L和E382L的突变。发现rRDE和rRDE突变体水解活性完全丧失,这表明E171和E382对于RDE发挥活性起到关键作用。通过定点突变技术将RDE中预测的N-糖基化位点249、390、401和459的Asn突变为Gln,在***中进行各突变体的分泌表达,测定不同突变酶的水解活性。结果显示,相同酶量条件下,突变酶N249Q、N390Q、N401Q和N459Q的活力分别为1.86×10、1.68×10、1.79×10和1.51×10 U·mg,未突变的rRDE的活力为1.96×10 U·mg,表明不同位点的N-糖基化修饰对RDE活性具有一定影响。于65°C分别保温3 min、6 min、9 min和12 min后各突变酶的活力测定显示,rRDE和突变酶N249Q、N390Q和N401Q保温12 min后活性损失为30%、28%、31%和32%。N459Q的活性损失为62%,暗示该单一N-糖基化位点的突变可能导致该酶的构象稳定性的降低。其次,论文为满足去糖基化研究的需求,从水稻中克隆并体外表达得到去糖基化酶OsPNGase A。OsPNGase A的最适反应温度为40°C,最适反应pH值为6.0,还原剂DTT和β-巯基乙醇在10-100 mM浓度范围内存在活性。OsPNGase A在变性条件下可以实现rRDE去糖基化反应;OsPNGase A能够去除来自植物糖蛋白中含有核心α-1.3岩藻糖的N-聚糖,说明OsPNGase A在植物源糖蛋白的研究中具有潜在应用价值,研究成果丰富了N-酰胺酶的来源。成功构建了RDE的基因敲除载体pBSE401-RDE和植物过表达载体pCAMBIA3301-RDE,并在苦荞叶肉细胞原生质体和在模式植物烟草中进行了瞬时表达。获得了Basta抗性和PCR鉴定阳性的烟草转基因植株。

关键词：芦丁降解酶催化机制苦荞 N-糖基化修饰 OsPNGase A 转基因

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

野生荞麦籽粒中芦丁降解酶的分离纯化

四川农业大学学报 2011年第3期29卷 391-396页

作者：唐宇邵继荣罗庆林郑亚迪孙俊秀四川农业大学生命科学与理学院四川雅安625014 四川烹饪高等专科学校成都610100

从野生荞麦种金荞麦籽粒中提取出芦丁降解酶,具有将芦丁降解为槲皮素的作用。该粗酶液用葡聚糖凝胶柱G-100和DEAE阴离子交换柱分离纯化后,最终酶的比活性由59.2 U/mg提高到671.4 U/mg,纯化倍数和回收率分别为11.3倍和3.5%。所得酶液经SD... 详细信息

从野生荞麦种金荞麦籽粒中提取出芦丁降解酶,具有将芦丁降解为槲皮素的作用。该粗酶液用葡聚糖凝胶柱G-100和DEAE阴离子交换柱分离纯化后,最终酶的比活性由59.2 U/mg提高到671.4 U/mg,纯化倍数和回收率分别为11.3倍和3.5%。所得酶液经SDS-PAGE检测酶分子量大小为60 kDa左右。对酶液反应条件进行研究,发现酶的最适温度为40℃,最适pH值为5.0。在工业生产上可借助芦丁降解酶以酶解法取代酸解法生产槲皮素。

关键词：野生荞麦芦丁降解酶槲皮素芦丁

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞种子萌发过程芦丁降解酶的代谢规律

西北农业学报 2010年第7期19卷 48-52页

作者：陈鹏侯智法西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

利用等吸收紫外分光光度法检测苦荞萌发过程中芦丁降解酶的活性,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)活性染色分析苦荞粉和萌发过程芦丁降解酶的同工酶谱,并对萌发过程黄酮质量分数的变化进行了分析。结果表明,建立的芦丁降解酶PAGE分析方法可... 详细信息

利用等吸收紫外分光光度法检测苦荞萌发过程中芦丁降解酶的活性,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)活性染色分析苦荞粉和萌发过程芦丁降解酶的同工酶谱,并对萌发过程黄酮质量分数的变化进行了分析。结果表明,建立的芦丁降解酶PAGE分析方法可以用于该酶的同工酶分析,苦荞种子中芦丁降解酶有4种同工酶。活性及同工酶电泳分析显示芦丁降解酶在种胚和内种皮中均有分布,胚中芦丁降解酶活性在籽粒萌发3 d内无明显变化,在萌发第4天开始迅速下降,至胚为子叶完全吸收后活性消失,而内种皮中芦丁降解酶在萌发过程中一直保持较高活性。整个萌发过程总黄酮呈上升趋势。推测芦丁降解酶在种子的萌发期并无新的合成。

关键词：苦荞萌发芦丁降解酶黄酮 Western blotting

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞中芦丁降解酶的基因克隆和重组表达

苦荞中芦丁降解酶的基因克隆和重组表达

作者：张学宾西北农林科技大学

学位级别：硕士

芦丁是苦荞(Fagopyrum tataricum)中一种重要的次生代谢物,具有抗高血糖、抗高血压、抗氧化的性质,被广泛应用于临床治疗。芦丁降解酶是特异性催化芦丁水解形成槲皮素的一类酶。对于芦丁降解酶的研究主要集中对天然芦丁降解酶的提取和... 详细信息

芦丁是苦荞(Fagopyrum tataricum)中一种重要的次生代谢物,具有抗高血糖、抗高血压、抗氧化的性质,被广泛应用于临床治疗。芦丁降解酶是特异性催化芦丁水解形成槲皮素的一类酶。对于芦丁降解酶的研究主要集中对天然芦丁降解酶的提取和酶学性质分析等方面,而对于其基因的克隆未有相关报道。本研究以芦丁降解酶的N端序列、二级质谱分析为基础,结合已报道的苦荞花的转录组数据SRR063703(GeneBank登录号SRX025322)为基础进行了以下工作:(1)从苦荞种子中纯化天然芦丁降解酶进行Edman测序,获得成熟芦丁降解酶N端的15个氨基酸残基;对纯化的芦丁降解酶样品进行MALDI-TOF二级质谱分析,de novo解析获得15条内肽序列。使用这16条肽段序列和转录组数据(SRR063703)进行序列比对和生物信息学分析,预测出芦丁降解酶的部分EST序列,使用EST序列设计引物扩增芦丁降解酶基因片段。(2)使用不同的引物对芦丁降解酶基因片段进行PCR扩增并测序分析,各个片段的序列经过拼接最终得到成熟芦丁降解酶的编码区序列为1431 bp。blastn比对未检索到相似的序列,表明其为从未报道的新序列。blastp分析显示其与蓼蓝(Polygonum tinctorium)的β-葡萄糖苷酶(登录号为BAA78708.1)相似度为62%,证明芦丁降解酶可能属于β-葡萄糖苷酶家族,这与芦丁降解酶的催化特性高度一致。二级结构预测分析表明其含有40.67%的无规卷曲。(3)将芦丁降解酶成熟蛋白编码区克隆到pET-28a(+)载体上进行His-tag融合表达,结果表明芦丁降解酶主要以包涵体的形式表达,包涵体复性后检测不到酶活性,这可能与原核表达的重组蛋白缺少糖链修饰而天然芦丁降解酶存在糖基化修饰有关。Western blot检测显示重组芦丁降解酶能够和天然的芦丁降解酶的多克隆抗体特异性结合,说明克隆的基因为芦丁降解酶的基因。综上所述,研究首次成功克隆了芦丁降解酶的基因,并对其进行了原核表达和Western blot鉴定。研究方法对于部分一级结构信息已知而无数据库同源信息蛋白的基因克隆有指导价值。芦丁降解酶基因的克隆为揭示苦荞芦丁降解酶的生物学功能以及深入研究苦荞的次生代谢奠定了基础,同时为芦丁降解酶的真核重组表达和非水酶学应用提供了基础信息。

关键词：芦丁降解酶 β-葡萄糖苷酶质谱克隆

苦荞芦丁降解酶纯化方法优化及其在籽粒萌发过程中代谢规律

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞芦丁降解酶纯化方法优化及其在籽粒萌发过程中代谢规律

作者：侯智法西北农林科技大学

学位级别：硕士

苦荞含有丰富的生物类黄酮物质,赋予其很高的药用价值。芦丁是苦荞黄酮的主要成分,对糖尿病、高血压、高血脂、心脏病、中风、胃病都有很好的辅助治疗作用。但与苦荞芦丁相对应的是苦荞粉中含有高活性的芦丁降解酶,该酶具有强的酸碱稳... 详细信息

苦荞含有丰富的生物类黄酮物质,赋予其很高的药用价值。芦丁是苦荞黄酮的主要成分,对糖尿病、高血压、高血脂、心脏病、中风、胃病都有很好的辅助治疗作用。但与苦荞芦丁相对应的是苦荞粉中含有高活性的芦丁降解酶,该酶具有强的酸碱稳定性和热稳定性,可专一性水解芦丁。荞麦食品加工过程中芦丁降解酶会造成芦丁降解,大大降低其药用价值。本研究对芦丁降解酶的研究方法、以及籽粒萌发过程中芦丁降解酶的代谢规律以及纯化方法进行了较为系统的研究,得到以下结果: 1根据槲皮素和芦丁溶解度差异,建立了利用PAGE活性染色检测苦荞粉中的芦丁降解酶的方法。结果表明:PAGE活性染色可以用来检测芦丁降解酶及其同工酶,苦荞籽粒中该酶至少四个芦丁降解酶的同工酶。利用纯化的芦丁降解酶通过不同上样量进行该方法的验证,结果显示同工酶的染色强度和芦丁降解酶的含量成正比关系。 2萌发过程中芦丁降解酶的代谢规律研究发现,芦丁降解酶在胚和内种皮中都有分布。胚中芦丁降解酶在萌发的前3 d,酶活性变化不大,在第4 d酶活性有大幅度下降,至第5 d则活性消失。内种皮中的芦丁降解酶始终保持较高活性。利用PAGE同工酶分析发现,胚中芦丁降解酶有三个同工酶,萌发第4 d,伴随酶活性的降低,同工酶条带消失。内种皮中芦丁降解酶在整个萌发过程始终保持三个同工酶条带的存在。利用本实验室制备的芦丁降解酶多克隆抗体,通过Western blotting对芦丁降解酶酶蛋白检测发现,杂交信号的强度与活性变化规律一致。在萌发过程中,苦荞总黄酮含量呈上升趋势。 3用不同终浓度的甲醇对芦丁降解酶进行耐受性试验,活性检测显示,当甲醇的终浓度低于50%时,芦丁降解酶的活性几乎没有变化,甲醇终浓度达到60%,芦丁降解酶活性急剧下降,至70%活性几乎消失。基于此结果,将用10倍体积醋酸缓冲液(pH 5.0,0.2 mol/L)提取的粗酶液与等体积甲醇混匀,沉淀杂蛋白,并结合阳离子交换层析和凝胶过滤层析,纯化了含量最为丰富的58 kD的芦丁降解酶,SDS-PAGE检测得到单一条带,PAGE活性染色和Western blotting均证实该纯化路线的可靠性。该纯化体系简化了本实验室原有芦丁降解酶纯化路线。通过本研究,建立了PAGE活性染色检测芦丁降解酶的方法,分析了籽粒萌发过程中芦丁降解酶代谢规律,首次报道了芦丁降解酶的同工酶。通过甲醇耐受实验,建立了芦丁降解酶纯化的快捷技术路线。这些结果为进一步揭示该酶的代谢规律和生物学功能提供背景资料和技术支持。

关键词：苦荞芦丁降解酶黄酮萌发 Western blotting

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化与其酶学性质研究

苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化与其酶学性质研究

作者：顾继娟西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着人们生活水平的提高,“三高”疾病(高血压、高血脂、高血糖)因其高发病率、高致残率、高致死率,已成为备受关注的社会性健康问题。在“三高”疾病的防治中,生物类黄酮物质发挥着十分重要的作用,并为医学界所普遍认可。苦荞以其丰富... 详细信息

随着人们生活水平的提高,“三高”疾病(高血压、高血脂、高血糖)因其高发病率、高致残率、高致死率,已成为备受关注的社会性健康问题。在“三高”疾病的防治中,生物类黄酮物质发挥着十分重要的作用,并为医学界所普遍认可。苦荞以其丰富的营养价值和独特的药用价值,被推崇为“21世纪最有前途的绿色食品”。苦荞籽粒含有丰富的生物类黄酮物质,其中芦丁约占总量的80%。芦丁具有多方面的生理功能,有抗氧化性、降血压、预防心脑血管疾病等功效。然而,苦荞含有高活性、高耐受性的芦丁降解酶,极大地限制了芦丁的提取、加工和利用。本研究利用硫酸铵沉淀法、疏水层析法、阳离子交换层析法、凝胶过滤层析法和电泳技术分离纯化苦荞籽粒中的芦丁降解酶,纯化蛋白在PAGE以及SDS-PAGE皆为单一条带,纯化倍数和得率分别为13.15和7.39%,SDS-PAGE显示其分子量为66kD。以纯化的蛋白为抗原免疫兔子,获得效价为1:10000的高效价多克隆抗体,该结果为进一步研究芦丁降解酶的生理功能奠定了基础。利用EDMAN降解法,测定得到芦丁降解酶N端15个氨基酸序列为:TVSRSSFPDGFLFGL,利用在线Blast软件分析该氨基酸序列,未得到已报道的相似序列。同时对纯化的蛋白进行基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI- TOF-MS)分析,肽指纹图谱比对未发现有报道的相似蛋白。芦丁降解酶的活性和稳定性研究表明,该酶在pH3.0～8.0之间皆有活性,其最适的pH值为5.0,且在该pH值时酶最为稳定。在温度为20℃～70℃之间,芦丁降解酶皆存在活性,其最适温度和最稳定温度为50℃。芦丁降解酶动力学研究表明,该酶的Km值和Vmax值分别为0.17mol/L和39.6U mg。Cu、Al、Zn、Mn、EDTA皆对芦丁降解酶活性有不同程度的抑制作用。本研究还在SDS-PAGE基础上建立了SDS-PAGE检测芦丁降解酶活性的分析方法,该方法极大地提高了酶检测方法的分辨率。结论:建立从苦荞籽粒(榆6-21)中分离纯化芦丁降解酶的方法,并且对该酶进行了研究,从而为芦丁降解酶的基因克隆、芦丁在苦荞中生理代谢机制、以及芦丁降解酶在芦丁代谢途径中的地位研究奠定了基础。

关键词：苦荞芦丁降解酶特性纯化多克隆抗体

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞芦丁降解酶基因启动子的克隆及功能分析

苦荞芦丁降解酶基因启动子的克隆及功能分析

作者：张钟仁西北农林科技大学

学位级别：硕士

芦丁作为苦荞（Fagopyrum tartaricum）中重要的黄酮类化合物,具有抗高血糖、抗高血压、抗氧化的性质。芦丁降解酶（Rutin degrading enzyme, RDE）是芦丁分解代谢中的关键酶之一,对芦丁产生特异的降解作用,造成终端产品中芦丁含量显著... 详细信息

芦丁作为苦荞（Fagopyrum tartaricum）中重要的黄酮类化合物,具有抗高血糖、抗高血压、抗氧化的性质。芦丁降解酶（Rutin degrading enzyme, RDE）是芦丁分解代谢中的关键酶之一,对芦丁产生特异的降解作用,造成终端产品中芦丁含量显著降低。本研究通过克隆芦丁降解酶基因启动子序列,利用生物信息学方法预测其上顺式作用元件,并对其进行5｀端截短,原生质体瞬时转化以及对外源信号物质的响应规律进行分析,进一步揭示芦丁降解酶基因的调控机制,为揭示其生物学功能及对苦荞次生代谢物的调控机制奠定了基础。本研究得到的主要结论有：（1）苦荞叶肉细胞原生质体的制备条件为：以苦荞叶片为材料,在1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5 mol/L mannitol+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液中,黑暗处理4 h,90×g离心速度收集原生质体,可以获得大量、细胞膜完整、高活力的原生质体,原生质体的产量为6×106个儋,活力达到90%以上。（2）通过染色体步移技术克隆得到了苦荞FtRDE启动子,长度为1907 bp。利用生物信息学手段进行分析,发现FtRDE启动子上的基本元件有：TATA-box （-60 bp）、CAAT-box （-131 bp）和转录起始位点（-30 bp）,同时,还具有1个茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif,-443 bp）、3个脱落酸响应元件（ABRE,-438 bp、-535 bp、-1145 bp）和1个种子特异性调节元件（RY repeat,-94 bp）。（3）通过对苦荞FtRDE启动子进行5｀端截短,构建5个FtRDE截短启动子重组载体FtRDEPR1、FtRDEPR2、FtRDEPR3、FtRDEPR4和FtRDEPR5,并将其转入苦荞叶肉细胞原生质体中进行瞬时表达分析,发现在FtRDE启动子上-1077 bp至-1829 bp区域存在抑制其转录的顺式作用元件。并通过实时定量分析发现,外源信号物质MeJA和ABA均能上调FtRDE的表达量,进一步证明了FtRDE启动子上存在响应MeJA和ABA的顺式作用元件。通过半定量分析发现,在苦荞灌浆期,FtRDE在种子中表达量最高,进一步证明了FtRDE启动子上存在种子特异性元件的可靠性。（4）分别将FtRDE正向、反向干扰片段和过表达片段插入到pTCK303载体中,成功构建苦荞FtRDE干扰载体（FtRDEi-pTCK303）和过表达载体（FtRDEm-pTCK303）,为深入研究芦丁降解酶的生物学功能奠定了基础。

关键词：苦荞芦丁降解酶启动子原生质体瞬时表达

苦荞芦丁降解酶基因多态性分析和蛋白重组表达及催化特性分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

苦荞芦丁降解酶基因多态性分析和蛋白重组表达及催化特性分析

作者：陈芳霞西北农林科技大学

学位级别：硕士

苦荞种子中含有高活性的芦丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),芦丁降解酶属于β-D-糖苷酶家族,能够降解芦丁生成槲皮素和芸香糖苷,是造成苦荞面粉苦味的主要原因。本研究利用实验室已克隆的芦丁降解酶基因,设计引物扩增RDE基因组DNA... 详细信息

苦荞种子中含有高活性的芦丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),芦丁降解酶属于β-D-糖苷酶家族,能够降解芦丁生成槲皮素和芸香糖苷,是造成苦荞面粉苦味的主要原因。本研究利用实验室已克隆的芦丁降解酶基因,设计引物扩增RDE基因组DNA,依据测序结果发现芦丁降解酶在基因组上存在3种拷贝形式rde1、rde2、rde3,其中rde1为无内含子的基因形式,rde2和rde3为有内含子的基因形式,rde3由12个外显子组成,rde2在rde3的第8外显子处插入新的内含子形成了13个外显子,两者相比外显子存在单碱基突变位点,内含子长度多态性是造成和两者差异的主要原因。相同的是rde2和rde3内含子中的AT含量高达70%,两者剪接位点碱基保守且遵循GT-AG规则。由此推测rde2和rde3可能为芦丁降解酶同源基因。在基因结构分析的基础上,构建rde真核重组表达载体pPICZαA-rde并转化毕赤酵母SMD1168H宿主菌,1%甲醇诱导诱导表达48 h后,表达上清硫酸铵分级沉淀,80%的丙酮洗涤溶解后,DEAE-Sepharose CL 6B纯化的蛋白经SDS-PAGE显示分子量为75KDa,重组芦丁降解酶(rRDE)分子量远大于预期分子量,PNGase F消化后分子量迁移到54 KDa,表明重组表达蛋白为N-连接的糖蛋白。研究建立了快速纯化苦荞籽粒芦丁降解酶的方法。利用芦丁降解酶对有机溶剂高耐受性的典型特性,基于不同浓度的甲醇对芦丁降解酶提取及活性的影响,结合非变性胶原位染色和酶活性分析确定芦丁降解酶提取最适甲醇浓度为40%,即在乙酸缓冲液提取后加入终浓度为40%的甲醇去除杂蛋白,在pH4.0条件下,提取液经强阳离子层析柱SP-Sepharose HP一步纯化得到分子量约为60 KDa的天然芦丁降解酶(nRDE),纯化效率可达70%左右。利用紫外分光光度计法对rRDE和nRDE的催化特性进行了比较分析,结果显示两者催化芦丁降解的最适p H均为5.0,rRDE最适温度为50℃,nRDE最适温度为40℃,催化芦丁的Km分别为5.375 mmol/L和11.333 mmol/L,nRDE的最大反应速率Vmax为是重组蛋白Vmax的10倍之多,推测不同来源芦丁降解酶翻译后修饰的不同是造成催化特性差异的主要原因。

关键词：苦荞芦丁降解酶基因多态性毕赤酵母重组表达催化特性