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波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA还原酶差异比较

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水产学报 2020年第3期44卷 495-504页

作者：毕伟伟冯立芳石双妮缪晨豪朱军莉田迪英浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异,本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28°C和4°C下的生长及三甲胺(TMA)、生物胺和挥发性盐基氮(TVB-N)的生成;通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲... 详细信息

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异,本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28°C和4°C下的生长及三甲胺(TMA)、生物胺和挥发性盐基氮(TVB-N)的生成;通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因(torA),利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示,杀鲑气单胞菌在28°C生长较快,而波罗的海希瓦氏菌在4°C生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺,波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺,在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因,2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%,而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52,甘氨酸含量最高,而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74,丙氨酸含量最高,蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA和鸟氨酸脱羧酶(DOC)基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见,波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌,其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强,与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。

关键词：希瓦氏菌气单胞菌致腐性 TorA

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大黄鱼腐败菌的低温致腐性及相互作用

福州大学学报（自然科学版） 2017年第5期45卷 748-753页

作者：张雯卞丹杨冬英方慧萍倪莉福州大学食品科学技术研究所福建省食品生物技术创新工程技术研究中心福建福州350116

以挥发性盐基氮、三甲胺和气味指纹图谱为表征,探讨腐败希瓦氏菌(***)、静止嗜冷杆菌(***)和荧光假单胞菌(***)在低温下对鱼肉的腐败性以及混合菌群在致腐过程中的相互作用.研究结果表明,腐败希瓦氏菌具有较强的产挥发性盐基氮特性,主... 详细信息

以挥发性盐基氮、三甲胺和气味指纹图谱为表征,探讨腐败希瓦氏菌(***)、静止嗜冷杆菌(***)和荧光假单胞菌(***)在低温下对鱼肉的腐败性以及混合菌群在致腐过程中的相互作用.研究结果表明,腐败希瓦氏菌具有较强的产挥发性盐基氮特性,主导腐臭气味;荧光假单胞菌具有类似的腐败趋势,但腐败性较腐败希瓦氏菌弱;静止嗜冷杆菌不具有显著的产挥发性盐基氮等特性,但能产生更为复杂的气味;荧光假单胞菌和静止嗜冷杆菌在腐败初期对腐败希瓦氏菌的腐败趋势有抑制作用.

关键词：腐败菌腐败希瓦氏菌静止嗜冷杆菌荧光假单胞菌致腐性大黄鱼

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低温气调包装下希瓦氏菌生物被膜对大黄鱼致腐性的影响研究

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低温气调包装下希瓦氏菌生物被膜对大黄鱼致腐性的影响研究

作者：王晓妹华南理工大学

学位级别：硕士

腐败希瓦氏菌是一种常见于海水和土壤中的革兰氏阴性细菌,在水产动物或富含蛋白的食品如大黄鱼的腐败过程中占主导地位。为了抵抗外界的恶劣环境,大多数细菌在自然界中是以生物被膜的形式存在。通常生物被膜的耐受性比浮游菌强,细菌一... 详细信息

腐败希瓦氏菌是一种常见于海水和土壤中的革兰氏阴性细菌,在水产动物或富含蛋白的食品如大黄鱼的腐败过程中占主导地位。为了抵抗外界的恶劣环境,大多数细菌在自然界中是以生物被膜的形式存在。通常生物被膜的耐受性比浮游菌强,细菌一旦形成生物被膜就不易被清除,从而对食品加工业产生危害。气调包装是一种较为成熟的食品保鲜技术,已被广泛运用到各类食品包装中,以期达到延长货架期的目的。然而,气调包装中的食品被微生物污染后具有形成生物被膜的潜在能力。目前,关于腐败菌在气调包装塑料膜上形成生物被膜的规律和特征的研究较少。因此,本文以腐败希瓦氏菌为研究对象,通过定量和定性的方法对腐败希瓦氏菌在包装塑料膜上形成的生物被膜能力进行评估。进一步研究了低温下腐败希瓦氏菌生物被膜与大黄鱼致腐性的关系以及气调对该菌产生物被膜的控制作用。本文研究内容和结论如下:(1)评估腐败菌希瓦氏菌在培养基中形成生物被膜的能力。首先以腐败希瓦菌作为研究对象,通过结晶紫染色、扫描电子显微成像和激光共聚焦三维成像技术研究生物被膜的黏附特征、基本形成规律和三维结构特点。结果表明,希瓦氏菌在LB培养基(p H=7),起始菌浓度为5.2×10CFU/m L,添加Na Cl质量分数为1.5%条件下成膜能力最强。然后在此条件下,希瓦氏菌在30C培养5天,会在48小时生物被膜到达成熟期,此时生物被膜OD=0.635。而在4C的冷藏温度下,生物被膜则在60小时到达成熟期,此时OD=1.014,说明4C条件下形成的生物被膜量比30C时多。通过扫描电镜图可以发现成熟的生物被膜内部结构相互交错,具有一定的厚度,呈多层次的网络状。另外,利用激光共聚焦显微镜观察发现培养24小时后细菌开始明显黏附,48小时后胞外多糖物质分泌增多、菌体逐渐堆积并形成具有立体结构的生物被膜。(2)研究低温下腐败希瓦氏菌在大黄鱼中形成生物被膜的规律和致腐作用。分别在大黄鱼汁和鱼块中研究低温条件下希瓦氏菌形成生物被膜的动态过程,通过测定该菌形成生物被膜的蛋白酶活力及对大黄鱼肉蛋白的分解能力,确定生物被膜对大黄鱼的致腐性。结果显示,在食品体系中腐败希瓦氏菌也能形成大量生物被膜,OD值最大为1.877。此外,生物被膜的蛋白酶活力的测定以及鱼肉蛋白的SDS-page的分析结果也证明腐败希瓦氏菌生物被膜的蛋白酶活力高于浮游菌。(3)探究气调包装条件对腐败希瓦氏菌生物被膜的控制作用。通过测定在气调包装下希瓦氏菌形成生物被膜的量及其蛋白酶的活性,评估气调对生物被膜的抑制作用。结果表明,无论是在纯体系或食品体系培养初期(12-36 h)气调都能够明显抑制生物被膜的形成,随着培养时间延长(48-120 h),生物被膜的量又会逐渐增加,最大值OD=0.953。其次,气调包装能对生物被膜的蛋白酶活性产生一定的抑制作用,使得蛋白酶的水解圈缩小1/3。另外,气调下希瓦氏菌的自动聚集性和疏水性也会显著增加,分别为56.74%和54.87%。

关键词：生物被膜腐败希瓦氏菌塑料膜气调包装致腐性

冷冻胁迫对荧光假单胞菌致病性和致腐性的影响及机理初探

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冷冻胁迫对荧光假单胞菌致病性和致腐性的影响及机理初探

作者：许瑛吉林大学

学位级别：硕士

荧光假单胞菌属于假单胞菌属,是好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌,经常与许多食品的变质有关,是牛乳及其制品和冷冻生鲜食品中常见的污染菌。冷冻冷藏作为食品行业重要的保藏手段可以一定程度降低微生物的生物活性,延长保质期,然而一旦冷... 详细信息

荧光假单胞菌属于假单胞菌属,是好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌,经常与许多食品的变质有关,是牛乳及其制品和冷冻生鲜食品中常见的污染菌。冷冻冷藏作为食品行业重要的保藏手段可以一定程度降低微生物的生物活性,延长保质期,然而一旦冷链中断或温度失控,残存的细菌将迅速恢复生长繁殖及致病能力,所以长期低温并不能消除微生物的致病性,致病风险甚至可能增加,在食品安全方面带来极大的危害。因此,本文就冷冻胁迫后荧光假单胞菌适温恢复过程中致病性、致腐性变化情况及其机制进行了研究。本研究首先采用一步数值分析法同时整合了动态和静态温度条件下荧光假单胞菌在鱼汁中的生长和存活情况,构建了不同温度下鱼汁中荧光假单胞菌的生长预测模型,得到相关参数a、Y 和T 的估计值分别为1.386×10、8.431Log CFU/m L和-4.68℃。根据得出的残留误差(ε)值,本研究构建的模型可以准确地预测加工、存储和零售过程中受污染的鱼汁中荧光假单胞菌的生长和进行风险评估。其次,本文研究了冷冻胁迫对荧光假单胞菌致病性的作用效果。通过绘制低温刺激后荧光假单胞菌在适温(30℃)恢复过程中的生长曲线,发现经冷冻胁迫的荧光假单胞菌在适温恢复2或4个小时后生长能力会显著增强。此外,结晶紫黏附实验结果表明冷冻胁迫3、6、9天后荧光假单胞菌在适温恢复3-5h生物被膜形成能力增强,琼脂糖凝胶电泳和Dot Blot结果为冷冻胁迫6、9天后荧光假单胞菌e DNA和PIA分泌量相应提高了57.8%-76.4%和14%-17%。通过研究荧光假单胞菌对兔血的溶血效果发现冷冻胁迫后其溶血活性增强。通过体外胃肠道模拟考察了荧光假单胞菌经过胃肠道后的存活情况,结果表明经冷冻胁迫后存活率提高,说明对胃肠道的适应性增强,从而有可能对人体产生更强的致病性。最后,本文对冷冻胁迫后荧光假单胞菌致腐性的变化及其机制进行了初步探究。通过脱脂乳平板和半固体培养基发现冷冻胁迫后荧光假单胞菌的胞外蛋白酶产量、群集性和泳动性均有增强。采用q RT-PCR法考察了冷冻胁迫对致腐蛋白相关基因的调控作用,结果显示经冷冻刺激3、6、9天的荧光假单胞菌适温恢复6h后基因fur的表达量增加为原来的1.77、19.16、19.16倍,冷冻6、9天恢复6h后clp P的表达量增加了2.94和1.06倍,说明冷激可能通过上调这些基因从而促进荧光假单胞菌的致腐能力。最后利用报告菌株CV026和GC-MS对QS信号分子AHLs的产量变化进行了定性和定量检测,发现冷激后信号分子产量均高于未经冷激的,C14-HSL结果尤为显著,提高了197.4%,表明冷冻刺激可促进荧光假单胞菌QS信号分子的产生。以上实验结果表明,荧光假单胞菌经冷冻胁迫一定天数后在适温恢复过程中致腐性和致病性均有增强,为进一步相关机制的研究及以相关蛋白为靶标进行低温抗菌剂的筛选奠定了基础。

关键词：荧光假单胞菌冷冻胁迫致病性致腐性群集运动

波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA差异比较

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波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA差异比较

波罗的海希瓦氏菌AI-2/LuxS对生物被膜和致腐的调控

中国食品科学技术学会第十五届年会

作者：毕伟伟唐蓉顾春涛繆晨豪刘丽朱军莉浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室

为研究冷藏水产品中特定腐败菌波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌的致腐性差异,分析两种腐败菌体外培养下生长曲线,三甲胺（TMA）和生物胺的生成及在鱼汁中挥发性盐基氮（TVB-N）的积累。并扩增测序两种腐败菌的三甲胺还原酶（TorA）基因... 详细信息

为研究冷藏水产品中特定腐败菌波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌的致腐性差异,分析两种腐败菌体外培养下生长曲线,三甲胺（TMA）和生物胺的生成及在鱼汁中挥发性盐基氮（TVB-N）的积累。并扩增测序两种腐败菌的三甲胺还原酶（TorA）基因,比较蛋白的同源性和理化特性。结果表明,在28℃培养下杀鲑气单胞菌生长趋势快于波罗的海希瓦氏菌,而在4℃培养下后者生长更快。相对于杀鲑气单胞菌,希瓦氏菌能产生较高含量的TMA和生物胺,在冷藏鱼汁中积累更高的TVB-N含量,表明希瓦氏菌具有很强的胺类代谢物生成能力。希瓦氏菌和气单胞菌中均扩增出约为2400 bp的TorA基因。序列同源性分析显示,两种TirA蛋白相似性为36.90%,波罗的希瓦氏菌中TorA蛋白的分子量和理论等电点约为92.3 k和6.52,而气单胞菌中约为90.6 k和6.74。可见,波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌均为水产品嗜冷腐败菌,其中前者具有更强的胺类代谢物生成能力,可能与TorA蛋白的氨基酸组成和蛋白理化特性不同,导致相关致腐酶活性的差异。研究为揭示食品腐败菌致腐机制提供了理论支持。

关键词：希瓦氏菌气单胞菌致腐性 TorA

来源： cnki会议评论

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微生物学报 2018年第7期58卷 1309-1321页

作者：叶晓锋严羽萍唐蓉朱军莉高海春浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室浙江杭州310018 浙江大学生命科学学院浙江杭州310058

【目的】波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)是冷藏海产鱼类的特定腐败菌。研究群体感应信号AI-2/Lux S对鱼源***生物被膜和致腐的调控作用。【方法】扩增SB11分离株的lux S基因,用自杀性质粒构建lux S基因缺失株,通过结晶紫染色、... 详细信息

【目的】波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)是冷藏海产鱼类的特定腐败菌。研究群体感应信号AI-2/Lux S对鱼源***生物被膜和致腐的调控作用。【方法】扩增SB11分离株的lux S基因,用自杀性质粒构建lux S基因缺失株,通过结晶紫染色、珠涡流法、显微镜观察和HPLC,比较分析野生株与缺失株△lux S在4°C和28°C下生物被膜形成、粘附能力、泳动性和致腐产物的差异。【结果】*** SB11中扩增获得lux S基因,生物信息学分析显示Lux S蛋白由169个氨基酸构成,含有保守的His-Thr-Leu-Glu-His(HTLEH)模体和关键氨基酸位点,蛋白三维空间结构与其他细菌相似。与野生株相比,△lux S缺失株上清荧光信号散失,但不影响生长,生物被膜形成期和成熟期的含量显著低于野生株,在4°C培养96 h和28°C培养24 h被膜分别减少20.1%和27.9%。缺失株在不锈钢片的粘附能力明显减弱,其中在4°C培养72 h和28°C培养24 h后的粘附量比野生株分别减少6.48%和6.57%。荧光显微镜观察发现,野生株能快速粘附于玻璃片,聚集形成大量生物被膜,而△lux S仅形成平坦稀疏的被膜,粘附细菌降低,CLSM证实野生株和△lux S的成熟被膜厚度分别为68.95μm和36.44μm。并且,△lux S株在4°C和28°C下泳动性均显著强于野生株。然而,野生株和△lux S株三甲胺和腐胺积累无差异。【结论】鱼源***中Lux S蛋白保守,AI-2/Lux S参与被膜、粘附能力及泳动性等多种生物被膜形成相关的调控作用,然而不是该菌致腐能力的功能性群体感应信号。

关键词： Shewanella baltica 群体感应AI-2 LuxS 生物被膜致腐性

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RpoS/RpoN蛋白对两种鱼源致腐菌调控作用探究

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RpoS/RpoN蛋白对两种鱼源致腐菌调控作用探究

作者：毕伟伟浙江工商大学

学位级别：硕士

微生物生长代谢是引起鲜活水产品腐败变质的重要原因之一。波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)具有较高的胺类物质代谢能力,而荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)较强的蛋白水解和生物被膜形成能力,使这两类细菌成为多种冷藏海... 详细信息

微生物生长代谢是引起鲜活水产品腐败变质的重要原因之一。波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)具有较高的胺类物质代谢能力,而荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)较强的蛋白水解和生物被膜形成能力,使这两类细菌成为多种冷藏海产鱼类的特定腐败菌(SSO)。水产品特定腐败菌在加工贮藏过程中能够克服多种环境胁迫压力优势生长引起腐败,推测与细菌胁迫应答因子Sigma相关。细菌中RpoS和RpoN蛋白分别为Sigma因子70家族与54家族主要成员,均能在胁迫应激、运动性能、毒力因子分泌等代谢过程中发挥重要调控作用,然而食源性致腐菌Sigma因子报道仍较少。为揭示致腐菌在环境胁迫下生长和代谢,探究RpoS/RpoN蛋白在希瓦氏菌和假单胞菌中的调节作用,研究分析水产致腐菌波罗的海希氏菌和荧光假单胞菌在三类胁迫环境中的生存和生物被膜形成能力,通过自杀性质粒和同源重组无痕敲除RpoS和RpoN蛋白,比较研究生长、被膜形成、运动性、抗胁迫性和致腐性的差异变化,解析希瓦氏菌RpoN在基因转录水平差异以及相关代谢通路。研究为揭示食品微生物致腐机制提供新的理论补充,为水产行业的健康发展夯实基础。主要结果如下:两株希瓦氏菌和两株假单胞菌在培养温度、营养和氧化胁迫条件下生长、生物被膜和蛋白酶活性出现明显变化。10℃、20℃、30℃培养24h易形成生物被膜,4℃生长缓慢,37℃不生长。在稀释1/5LB下生物被膜形成量锐减,而1/10LB基本不生长;在2%或更高浓度葡萄糖培养下生物被膜形成量增加;但1%%NaCl高渗培养抑制生物被膜形成。4种金属离子Fe、Cu、Mg、Ca浓度与两种致腐菌生长和生物被膜形成密切相关,0.3mmol/L Fe、0.3mmol/L Cu、1mmol/L Mg和10mmol/L Ca培养时促进生物被膜形成。希瓦氏菌和假单胞菌在0mg/mL乙酸、0.2%次氯酸钠浓度下生物被膜形成量依次降低,粘附性下降。在3%NaCl和3%葡萄糖胁迫培养时,希瓦氏菌粘附能力无明显变化,假单胞菌在3%NaCl胁迫下菌体粘附量下降,但3%葡萄糖反而刺激粘附能力。同样4株菌在3%葡萄糖促进蛋白酶活力,而3%NaCl酶活力下降。研究发现扩增的希瓦氏菌和假单胞菌RpoS蛋白相似性为86.16%。构建希瓦氏菌和假单胞菌的rpoS基因缺失株(ΔrpoS),比较两致腐菌野生株与ΔrpoS株的生长、生物被膜、抗胁迫性和致腐能力差异。显示RpoS缺失不影响两种致腐菌的生长及希瓦氏菌的生物被膜,在高葡萄糖、高氯化钠、酸性环境下假单胞菌ΔrpoS显著高于野生株,希瓦氏菌野生株和ΔrpoS无差异。希瓦氏菌ΔrpoS泳动性减弱,鞭毛缩短,但不影响假单胞菌ΔrpoS的泳动。在灭菌鱼汁中希瓦氏菌ΔrpoS株三甲胺(TMA)含量减少,胞外多糖(EPS)生成增加,不影响蛋白酶和TVB-N含量,假单胞菌ΔrpoS株蛋白酶和EPS形成也增加。在30%NaCl、10%乙醇、45℃、10mmol/L过氧化氢、0.001%次氯酸钠、150μg/mL结晶紫胁迫环境中希瓦氏菌野生株的存活率分别是ΔrpoS的1.25、2.42、4.55、1.76、8.32和3.62倍,而假单胞菌野生株是ΔrpoS株的1.01、9.00、1.11、8.80、1.26和1.31倍,RpoS蛋白显著增强两种菌的抗高盐、热和氧化胁迫能力(P性为86.24%。构建了希瓦氏菌和假单胞菌rpoN基因缺失株(ΔrpoN),比较野生株和ΔrpoN生长、生物被膜、抗胁迫性、耐药性和致腐能力的差异。结果显示,希瓦氏菌和假单胞菌ΔrpoN株延缓生长速度,不影响细菌数量。ΔrpoN在培养前24h被膜低于野生株,而36h后高于野生株,表明RpoN缺失也减慢生物被膜的发展,而高氯化钠和酸性环境抑制两种致腐菌ΔrpoN被膜形成。希瓦氏菌和假单胞菌ΔrpoN几乎丧失泳动性,透射电镜观察发现两株ΔrpoN无鞭毛结构。希瓦氏菌ΔrpoN除30%NaCl和10mmol/L过氧化氢处理外,10%乙醇、45℃、0.001%次氯酸钠和150μg/mL结晶紫处理后存活率显著减少(P性更强,在测试的19种抗生素中希瓦氏菌ΔrpoN株降低18种抗生素耐药性,而假单胞菌ΔrpoN减弱15种抗生素耐药性(P致腐菌ΔrpoN的群体感应活性显著降低,其中希瓦氏菌ΔrpoN中与致腐调控相关的cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)两种DKPs分泌显著降低,假单胞菌ΔrpoN中AHLs活性明显减少,特别是C-HS

关键词：希瓦氏菌假单胞菌 RpoS RpoN 致腐性胁迫能力

蜂房哈夫尼菌luxI、luxR基因对群体感应调节机制的初步研究

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蜂房哈夫尼菌luxI、luxR基因对群体感应调节机制的初步研究

作者：刘丽大连工业大学

学位级别：硕士

蜂房哈夫尼菌常见于腐败食品中,菌能够在冷藏的环境中生长,危害产品的品质,缩短货架期。本实验室从腐败的海参中分离获得一株产群体感应信号分子的蜂房哈夫尼菌,本文主要检测蜂房哈夫尼菌在海参中的致腐能力,探究群体感应基因luxI、lux... 详细信息

蜂房哈夫尼菌常见于腐败食品中,菌能够在冷藏的环境中生长,危害产品的品质,缩短货架期。本实验室从腐败的海参中分离获得一株产群体感应信号分子的蜂房哈夫尼菌,本文主要检测蜂房哈夫尼菌在海参中的致腐能力,探究群体感应基因luxI、luxR以及群体感应信号分子C-HSL对蜂房哈夫尼菌生物学性状的影响,旨在初步了解蜂房哈夫尼菌的致腐性及群体感应作用机理,为后续延长海参货架期提供理论依据。将蜂房哈夫尼菌接种到无菌海参中检测腐败指标,确定蜂房哈夫尼菌的致腐能力,研究结果表明:接种蜂房哈夫尼菌野生株及突变体的无菌水发海参在20℃贮藏15天后,蜂房哈夫尼菌野生株菌数为8.55 Log(CFU/mL)、ΔluxI菌数为8.52 Log(CFU/mL)、ΔluxR菌数为8.39 Log(CFU/mL)、ΔluxI/R菌数为8.76 Log(CFU/mL);接种蜂房哈夫尼菌野生株、ΔluxI、ΔluxR及ΔluxI/R的海参挥发性盐基氮含量分别为15.05 mg/100g、6.12 mg/100g、8.01 mg/100g、3.45 mg/100g。蜂房哈夫尼菌蜂房哈夫尼菌具有致腐性,能够在海参中生长繁殖,并促进挥发性盐基氮的产生,降低海参的品质。对比蜂房哈夫尼菌野生株与突变体生物学性状的变化,确定群体感应基因luxI、luxR对蜂房哈夫尼菌本身的影响。研究结果表明:蜂房哈夫尼菌的生长不受群体感应基因luxI、luxR的影响;luxI基因控制蜂房哈夫尼菌信号分子C-HSL的产生,C-HSL的浓度在培养16h时达到最高,将luxI基因敲除后蜂房哈夫尼菌的上清液中检测不到C-HSL。群体感应基因luxI、luxR影响蜂房哈夫尼菌的运动能力以及生物膜形成能力,作用机制尚不明确。此外,本文探究了蜂房哈夫尼菌产的群体感应信号分子C-HSL对蜂房哈夫尼菌生物学性状的影响。研究结果表明:蜂房哈夫尼菌的生长不受群体感应信号分子C-HSL影响;C-HSL能在一定浓度范围内促进蜂房哈夫尼菌的泳动性;外源C-HSL对蜂房哈夫尼菌的生物膜形成影响不显著。

关键词：蜂房哈夫尼菌群体感应 luxI、luxR基因 N-己酰高丝氨酸环内酯生物学特性致腐性

冷鲜牛肉特定腐败菌假单胞菌鉴定及肉桂醛对其抑制的研究

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冷鲜牛肉特定腐败菌假单胞菌鉴定及肉桂醛对其抑制的研究

作者：顾春涛浙江工商大学

学位级别：硕士

牛肉是中国仅次于猪肉的第二大消耗肉品,2017年国内消费量达到789万吨,具有较好的行业前景。冷鲜肉能良好地保持肉品风味和营养价值,逐渐成为肉类消费的主流。冷鲜牛肉在冷链贮运中由于自溶酶和嗜冷微生物繁殖代谢不断积累醛、酮、胺、... 详细信息

牛肉是中国仅次于猪肉的第二大消耗肉品,2017年国内消费量达到789万吨,具有较好的行业前景。冷鲜肉能良好地保持肉品风味和营养价值,逐渐成为肉类消费的主流。冷鲜牛肉在冷链贮运中由于自溶酶和嗜冷微生物繁殖代谢不断积累醛、酮、胺、有机酸等物质,导致品质下降,甚至腐败变质。在肉品复杂的微生物菌群中,只有一种或几种特定微生物在腐败中起着主导作用,即特定腐败菌。植物提取物具有抗氧化活性、抑菌或杀菌活性,有利于提高食品的安全性,延长食品保质期。肉桂醛已被美国食品和药物管理局批准用于食品,它对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病性有良好的抗菌活性。目前牛肉在低温贮藏下品质研究主要集中在腐败菌鉴定,而冷链中牛肉微生物菌群结构和特定腐败菌的控制仍有待于研究。鉴于此,本研究采用培养依赖的16S rDNA结合非培养的高通量测序分析冷鲜牛肉在0℃下微生物菌群变化及优势腐败菌,评价其致腐和生物被膜形成能力,比较反式肉桂醛和顺式肉桂醛对特定腐败菌抑菌及抗生物被膜的活性,通过荧光定量PCR(RT-PCR)检测相关基因表达量的影响。研究为较全面了解冷鲜牛肉中微生物动态变化,探寻植物提取物抑制腐败菌,为高品质牛肉冷鲜技术的研发提供参考。主要结果如下:1、分析了牛肉冷藏过程中品质变化和微生物群落结构变化。牛肉冷藏中感官品质保持良好,18d有腐臭味,且TVB-N值和TBA值分别在15d、18d超过限值。而样品中菌落总数第3d快速上升,第9d菌落总数为6.75 1g cfu/g,之后呈现稳定趋势,CFC、STAA、VRBA和MRS中细菌增长与菌落总数趋势相似,其中假单胞菌增长最快,肠杆菌数和乳酸菌数增长最慢。牛肉的感官评分与理化指标和微生物指标、理化指标与菌落总数均存在显著相关性。培养依赖的16S rDNA测序发现,冷鲜牛肉贮藏初期细菌表现多样性,包括热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta,30.77%)、气单胞菌属(Aeromonasspp,23.08%)和不动杆菌属(Acinetobacter spp,15.38%)等7种细菌。而高通量测序显示样品初期有嗜冷杆菌属(Psychrobacter,34.78%)、假单胞菌属(Pseudomonas,22.64%)和乳杆菌属(Lactobacillus,12.21%)等9种细菌构成。而腐败终点细菌种类明显下降,两种鉴定方法均显示假单胞菌和热死环丝菌为优势菌。采用grB基因鉴定10株腐败假单胞菌分离株,发现莓实假单胞菌(***)占50%,其次为隆德假单胞菌(***,30%)和荧光假单胞菌(***,20%)。研究表明,冷鲜牛肉在0℃贮藏的货架期约为12d,假单胞菌是导致牛肉品质下降的优势致腐菌。2、评价假单胞菌、热死环丝菌和蜂房哈夫尼菌15株腐败分离株在无菌牛肉汁/牛肉的致腐性,采用结晶紫微孔板染色法、珠涡流法等分析腐败菌的生物被膜形成和粘附性特性。结果表明,牛肉汁平板筛选发现假单胞菌PS16、PS17和PS28对牛肉肌浆蛋白有较强的分解。腐败分离株28℃下在无菌牛肉汁中生长速率相近,其中蜂房哈夫尼菌细菌密度最高,假单胞菌次之,而0℃下假单胞菌生长较快。接种假单胞菌和蜂房哈夫尼菌的牛肉汁感官评分、pH值和TVB-N显著高于热死环丝菌,且假单胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30具有较强的蛋白酶活性,其中隆德假单胞菌PS28在牛肉汁中的致腐性最强。体外生物被膜分析显示,假单胞菌生物被膜形成强于其他两种致腐菌,热死环丝菌被膜形成微弱。在三个种属腐败菌中,假单胞菌具有较强的被膜形成能力,分泌较多的胞外分泌物和粘附量,其中隆德假单胞菌PS28、PS17和PS27能力较强。同时,培养温度也影响腐败菌的被膜形成,假单胞菌在0℃下生物被膜形成较慢,而成熟被膜为28℃的2.88～10.99倍。并且,假单胞菌PS17、PS27和PS28泳动性最强,而热死环丝菌和哈夫尼菌无泳动性。将筛选的强致腐株PS28、PS16和PS17进一步接种无菌牛肉,显示在0℃贮藏15d后PS28的感官评分和TVB-N值显著大于其他两株菌,腐败风味物质主要为乙酸乙酯。可见,肉源优势腐败菌中假单胞菌具有较强致腐能力,而假单胞菌分离株间的致腐性和被膜形成能力存在差异,其中隆德假单胞菌PS28为特定腐败菌。3、研究肉桂醛对特定腐败菌隆德假单胞菌PS28致腐性和生物被膜形成的抑制作用。反式肉桂醛和顺式肉桂醛均能抑制隆德假单胞菌的生长,最小抑菌浓度(MIC)分别为200和225 μg/mL。亚抑菌浓度1/8、1/4、1/2 MIC的反式肉桂醛分别降低32.88%、47.95%和60.27%被膜结晶量,而顺式肉桂醛分别减少26.03%、41.10%和52.05%。三种亚抑菌浓度的反式肉桂醛分别

关键词：牛肉假单胞菌致腐性生物被膜肉桂醛